• РЕАГЕНТ № 2 - РАСТВОР 2,4-ДНФГ

  • Скачать 64.55 Kb.


    Дата06.07.2017
    Размер64.55 Kb.

    Скачать 64.55 Kb.

    Алат-витал-01/11



    АлАТ-ВИТАЛ-01/11
    НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ В СЫВОРОТКЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ УНИФИЦИРОВАННЫМ МЕТОДОМ РАЙТМАНА-ФРЕНКЕЛЯ




    Кат. № В 01.01 - 400 определений

    Кат. № В 01.11 - 1000 определений

    (при объеме пробы 3,05 мл)
    ПРИНЦИП МЕТОДА
    1. L-аланин + -кетоглутарат АлАТ  пировиноградная кислота + L-глутамат

    2. фотометрическое определение содержания пирувата в пробе на основе реакции с 2,4-динитрофенилгидразином


    ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ (ОБРАЗЕЦ)
    Свежая сыворотка или плазма крови без следов гемолиза
    СОСТАВ НАБОРА
    РЕАГЕНТ № 1 - СУБСТРАТНАЯ СМЕСЬ

    D, L-аланин…………….........................……...0,2 моль/л

    -кетоглутаровая кислота…………..............2,0 ммоль/л

    фосфатный буфер, рН 7,4.………………........0,1 моль/л


    РЕАГЕНТ № 2 - РАСТВОР 2,4-ДНФГ

    ………….………………………………….…1,0 ммоль/л


    РЕАГЕНТ № 3 - КАЛИБРАТОР

    Пируват натрия…………...………………...1,0 ммоль/л


    РЕАГЕНТ № 4 - НАТРИЙ ЕДКИЙ

    NaOH.………………………………………....4,0 моль/л


    АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
    Линейность - отклонение не более 10 %

    в диапазоне активностей 0,067-1,25 мкмоль/(сл)

    Чувствительность - не более 0,05 мкмоль/(сл)

    Коэффициент вариации – не более 10 %

    Время проведения анализа – 60 мин
    ХРАНЕНИЕ


    1. Срок годности набора – 12 мес

    ( хранение при 18-25С).

    1. Срок хранения вскрытых реагентов №№ 1 и 3 –12 мес

    ( хранение при 2-4С).

    1. Срок хранения вскрытых реагентов №№ 2 и 4 –12 мес

    ( хранение при 18-25С).
    ВНИМАНИЕ! Тщательно закрывайте флаконы непосредственно после каждого использования реагентов.
    ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧЕГО РЕАГЕНТА
    Содержимое флакона № 4 (или аликвоту) развести бидистиллированной водой, свободной от карбонатов, в 10 раз (например, 1 мл реагента № 4 + 9 мл бидистиллированной воды).

    Концентрация NaOH в полученном рабочем реагенте – 0,4 моль/л.

    Срок хранения – 3 месяца в плотно закрытой полиэтиленовой таре при 18-25С.
    ПРИМЕЧАНИЯ


    1. При активности АлАТ, превышающий 3 ммоль/(чл) 0,834 мкмоль/(сл), сыворотку крови следует развести. При расчете активности учесть степень разведения.

    2. 1U/л=16,67 нмоль/(сл)=

    0,0167 мкмоль/сл=0,06 ммоль/чл

    ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА


    ПОСТРОЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНОГО ГРАФИКА




    1

    2

    3

    4.1

    4.2

    Проба 1

    0,05

    0,55

    0,50

    0,278

    1,0

    Проба 2

    0,10

    0,50

    0,50

    0,556

    2,0

    Проба 3

    0,15

    0,45

    0,50

    0,834

    3,0

    Проба 4

    0,20

    0,40

    0,50

    1,112

    4,0

    Проба 5

    0,25

    0,35

    0,50

    1,390

    5,0

    Проба 6

    0,30

    0,30

    0,50

    1,668

    6,0

    Контроль
    Проба

    -

    0,60

    0,50

    -

    -




    1. Реагент № 3 (калибратор), мл

    2. Бидистиллированная вода, мл

    3. Реагент № 2 (раствор 2,4-ДНФГ), мл

    4.1. Концентрация каталитической активности АлАТ (С) в калибровочной пробе, мкмоль/(сл)

    4.2. Концентрация каталитической активности АлАТ (С) в калибровочной пробе, ммоль/(чл)


    Внести в пробирки компоненты 1-3, перемешать, инкубировать 20 мин при 18-25С. Добавить во все пробир-ки по 5,0 мл рабочего реагента, перемешать и фотометри-ровать через 5-10 мин против контроля.
    ИЗМЕРЕНИЕ
    Длина волны: 500-560 нм (opt=537нм).

    Длина оптического пути: 1 см.

    Температура инкубации : 1. 37С

    2. 18-25С

    Внести в пробирки:





    Опытная проба

    Холостая проба

    Реагент № 1

    0,25 мл

    0,25 мл

    Образец

    0,05 мл

    -

    Пробы перемешать и инкубировать в водяной бане 30 мин при 37 С.

    Добавить в пробирки:





    Опытная проба

    Холостая проба

    Реагент № 2

    0,25 мл

    0,25 мл

    Образец

    -

    0,05 мл

    Пробы перемешать и инкубировать 20 мин при 18-25С.

    Далее внести в пробирки по 2,5 мл рабочего реагента, перемешать.

    Фотометрировать через 5-10 мин против холостой пробы.

    Стабильность окраски – не менее 30 мин.

    Расчет активности фермента в сыворотке и плазме крови производят по калибровочному графику.


    РАСЧЕТЫ


    1. По калибровочному графику рассчитать коэффициент k=C/А,

    где: А – адсорбция калибровочной пробы;

    С – концентрация каталитической активности АлАТ в этой пробе.

    2. Каталитическая концентрация АлАТ (активность) в опытной пробе рассчитывается в мкмоль/(сл) или ммоль/(чл) по формуле: (Аоп – Ахол ) k,

    где: k – коэффициент, рассчитанный по калибровочному графику,

    Аоп - адсорбция опытной пробы,

    Ахол - адсорбция холостой пробы.


    НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ
    0,028 – 0,190 мкмоль/(сл) или 0,1 – 0,68 ммоль/(чл) при 37С
    КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
    Правильность проверена при помощи контрольных сывороток “Sigma enzyme control 2N” & “Sigma enzyme control 2E” (Sigma chemical company, USA).