Скачать 232.73 Kb.


Дата13.06.2018
Размер232.73 Kb.

Скачать 232.73 Kb.

Кортикальный слой кора in vitro искусственно, в пробирке



кортикальный слой – кора

in vitro – искусственно, в пробирке

meshwork – сетчатая структура, полносвязная сеть

ATP = АТФ – Аденозинтрифосфат

ADP = АДФ - Аденозиндифосфат

Движения фрагментов миозина и компактные мембраносвязанные нити актина

Abstract

Коррекция кортикального слоя клетки во время клеточного деления является результатом миофиламент-управляемой сокращаемости корковой мембраносвязанной сетки актина. Мало известно о взаимодействии между отдельным миофиламентами и мембраносвязанными нитями актина. Здесь мы воссоздавали минимальную кору актина, чтобы непосредственно визуализировать действие отдельных миофиламентов на мембраносвязанне нити актина, используя микроскопию TIRF. Мы показываем, что синтетические фрагменты миофиламента и компактный мембраносвязанный актин поступательно проходят нити актина. Мы предлагаем механизм, посредством которого напряжение накапливается между концами миофиламентов, в результате чего сила сжатия, действующая на отдельные нити актина, вызывает их деформацию и поломку. Моделирование этого механизма показало, что достаточная сила (∼20 pN) может быть произведена путем отдельных миофиламетов, чтобы согнуть и сломать нити актина. Этот механизм фрагментации нити и уплотнения может способствовать обороту актина и перестройке коры во время цитокинеза.

Introduction

Кортикальный слой актина состоит из тонкой актиновой сетки, связанной с внутренней цитозольной стороной плазменной мембраны различными якорными белками (Мороне и др., 2006). Это играет основную роль в обеспечении механической стабильности в клеточной мембране, и в управлении изменениями формы клетки во время передвижения клетки и клеточного деления (Вессельс и др., 1971; Брей и Вайт, 1988; Диз-Муньоз и др., 2010; Седзинский и др., 2011). Многие из этих особенностей полагаются на надлежащее функционирование моторного миозина актина II (Де Лозанн и Спудич, 1987; Крамер и Мичисон, 1995). Миозин II в коре актина функционирует как узлы моторных белков, формирующих анти-параллельные расположенные биполярные нити (миофиламенты) с моторными областями и на концах нити ((Verkhovsky и Borisy, 1993; Verkhovsky и др., 1995), рисунок 1A). Помимо того, чтобы быть генератором силы, необходимым для модернизации коры клетки и кольцевого сжатия актомиозина во время цитокинеза, есть доказательства, что миофиламенты также способствуют обороту нити актина во время цитокинеза (Бюргер, 2005; Guha и др., 2005; Мерти и Уодсуорт, 2005). Во всех этих процессах не понятен микроскопический механизм взаимодействия между отдельными миофиламентами и мембраносвязанными нитями актина. Из-за обширной сложности клеточных систем, много усилий было потрачено, чтобы исследовать последствия актин-миозин взаимодействий с точки зрения iv vitro («в пробирке», искусственно; наверное, имеется в виду искусственное воспроизведение этих процессов). (Backouche и др., 2006; Смит и др., 2007; Schaller и др., 2010; Колер и др., 2011; Соарес e Сильва и др., 2011; Гордон и др., 2012; Рейман и др., 2012). Однако эти исследования сосредоточились на вызванном миозином формировании структуры актина в мезоскопическом масштабе, а не во взаимодействии между актином и отдельным миофиламентами. Кроме того, мембраносвязанные минимальные системы актина только недавно начали функционально воссоздаваться (Фогель и Швилл, 2012). Чтобы заполнить промежуток в понимании отдельных взаимодействий миофиламента-актина, мы непосредственно визуализировали действие миофиламентов на мембраносвязанных нитях актина в минимальной in vitro системе и дополнили экспериментальные результаты теоретической моделью.

eLife digest

Актин является многофункциональным белком, который найден в почти всех эукариотических клетках. Когда полимеризируется, он формирует прочные нити, которые участвуют во множестве клеточных процессов. Например, нити актина вовлечены в сокращение мышц, и они - также главный компонент в различных структурах, которые поддерживают и управляют формой клеток, когда они двигаются и делятся. Эти структуры включают кортикальный слой клетки, связную сеть нитей актина, которая связана с внутренней поверхностью плазменной мембраны якорными белками. Однако и кортикальный слой клетки, и плазменная мембрана должны претерпеть серьезные изменения, когда клетка делится, и силы, которые ведут эти изменения, произведены другим белком, миозином II.

Миозин II содержит три области: главная область, также известная как моторная область, которая связывает с актином; область шеи; и область хвоста. Как актин, миозин II белков также формирует нити, но у этих миофиламентов есть отличительная структура: хвостовые области двух Миозин II белков объединяются с моторными областями, находящимися в обоих концах нити. Когда активирована, моторные области захватывают нити актина и тянут против них в «рабочий ход». Однако детали взаимодействий между моторными областями миофиламентов и нитями актина в кортикальном слое клетки, которые связаны с плазменной мембраной, не полностью поняты.

Изучение этих процессов в живых клетках чрезвычайно сложно, таким образом, Фогель и др. построил iv vitro модель кортикального слоя клетки, и затем использовал отображение отдельной молекулы, чтобы наблюдать взаимодействия между миофиламентами и нитями актина в этой модели. Они показывают, что миофиламенты проходят актин в коре, разбивая нити и сжимая их в процессе. Они предлагают, чтобы напряженность росла между концами миофиламенов, приводя к сжимающему усилию, проявляемому на нитях актина. Компьютерные моделирования подтверждают, что произведенные силы достаточно высоки, чтобы заставить нити актина сгибаться и ломаться. In vitro модель, развитая Фогелем и др., должна позволить исследователям разъяснять основные биофизические принципы, которые подкрепляют структуру и функцию кортикального слоя клетки.



Results

Чтобы имитировать кортикальный слой клетки, мы развивали ‘минимальную кору актина’ (MAC), состоящую из нитей актина, соединенных с поддержанным двойным слоем липида через биотин нейтравидин связи (рисунок 1A). Мы использовали Алекс-488-фаллоидин, стабилизированную, а также неустойчивую (данные не показаны) нити актина для состава MAC. Изменяя количество биотинилированных липидов, существующих в двойном слое липида, мы управляем плотностью слоя актина (рисунок 1B). Чтобы понять, что происхождение сокращаемости наблюдало в коре клетки, мы проверили ответ MAC после добавления движений миозина. Миозин II мышцы кролика был очищен и повторно собирал формирующийся биполярный синтетический продукт миофиламентов с типичной длиной 500-600 нм (рисунок 1C). Отображение промежутка времени MAC-ов с различными удельными весами актина, используя микроскопию флюоресценции полного внутреннего отражения (TIRFM), показало динамическую перестановку нитей актина, и впоследствии формирование очагов актомиозина ATP-зависимым способом немедленно после добавления миофиламентов (рисунок 1D, ролик 1). Формирование рисунка актина произошло при концентрациях ATP между 0.1-1 мкм в системах, где ATP ферментативным образом восстановлена (Таблица 1) в 94% экспериментов (n = 45 экспериментов). При более низкой концентрации ATP, формирование рисунка актина в MAC отсутствует. О формировании структуры актина после истощения ATP также сообщили для экспериментов, используя актин и миофиламенты в решении (Смит и др., 2007). При низких концентрациях ATP миофиламенты были предсказаны, чтобы функционировать как активный временный соединитель, который может вести самособрание нитей актина в группы актина.

Чтобы понять детали взаимодействий миофиламента-актина при низких концентрациях ATP во время формирования рисунка актина, мы добавили миофиламенты к MAC-ам низкой плотности. Если бы соединение актина миофиламентами было единственной предпосылкой для формирования рисунка, то мы не ожидали бы (быстрого) формирования рисунка в MAC-ах низкой плотности, из-за больших расстояний между нитями актина относительно длины миофиламентов. Поразительно, добавление миофиламентов к MAC-ам низкой плотности показало события поломки и уплотнения нитей актина, приводящих к их сокращению в течение долгого времени во всех экспериментах (n = 21, рисунок 2A-C, ролик 2). После 20 минут большинство нитей актина было сокращено к, в среднем, половине их длины образца до испытания, и большинство фрагментов соединялось в отдельные очаги (рисунок 2A, B, Кино 2). Обратите внимание на то, что нити актина оставались неповрежденными, когда представлены в отсутствие миофиламентов (данные, не показанные). После добавления миофиламента нити актина часто показывали деформации до поломки нити актина (Рисунок 2C, желтые стрелки, ролик 3), указывая, что сила проявлена миофиламентами, и напряжение вдоль нити актина может выстроиться вплоть до разрывов нити актина. Точно так же недавние доказательства подразумевали, что воздействие связок актин/фаскин с миофиламентами может вызвать их разборку и разъединение неизвестным процессом (Backouche и др., 2006; Haviv и др., 2008; Торесен и др., 2011).

Кроме того, увеличение интенсивности флюоресценции вдоль остающейся нити актина часто наблюдается после события фрагментации (Рисунок 2C, белые стрелки, рисунок 2D, E). Интенсивность флюоресценции, ближайшая к месту поломки, приблизительно вдвое более высока по сравнению с остальной частью нити актина, предполагая, что фрагмент тянется вдоль остающейся нити актина, приводящий миофиламенты к их уплотнению (рисунок 2C-E, Кино 3). Мы предполагаем, что фрагментация и уплотнение способствовали наблюдаемому соединению фрагментов актина в отдельные очаги во время динамической перестановки нитей актина (Рисунки 1D и 2A, Ролики 1 и 2).

Чтобы определить, как миофиламенты выполняют фрагментацию и уплотнение и проверить, требуют ли эти процессы (организованные) действия множества миофиламентов, мы уменьшали концентрацию миофиламентов до уровня отдельной молекулы. Алекс-647 маркировала миофиламенты, добавленные к MACам с низкой плотностью актина и отмеченные двухцветным TIRFM. После закрепления единичных миофиламентов к отдельным нитям актина мы наблюдали направленное движение миофиламентов вдоль нитей актина и фрагментации актина при низких концентрациях ATP (рисунок 3A, Кино 4, Таблица 1, рисунок 5). 68% индивидуально наблюдаемых миофиламентов показали направленное движение и 50% продемонстрировали фрагментацию и уплотнение нити актина (общее количество миофиламентов = 152; 7 экспериментов). В случаях, где и фрагментация, и уплотнение произошли, 95% наблюдаемых миофиламентов показали направленное движение вдоль нитей актина, в то время как 5% оставались постоянными в своем исходном связывающем участке (общее количество фрагментирования миофиламентов = 75; семь экспериментов).

Напротив, при высоких концентрациях ATP поступательное движение миофиламентов было едва заметно, и фрагментация нитей актина отсутствовала (дополнительный текст в ‘Материале и методах’, рисунок 5, Кино 5).

Вскоре после закрепления миофиламентов нити актина искажались и в конечном счете ломались, указывая на то, что сила, произведенная единичным миофиламентом, достаточна, чтобы сломать нить актина (Рисунок 3A, желтые стрелки, Кино 4). Впоследствии, сигнал флюоресценции нитей актина, ближайших к месту поломки, увеличился (Рисунок 3A, белые стрелки, рисунок 3C). Обнаруженное увеличение интенсивности флюоресценции нитей актина подразумевает, что фрагменты актина являются протаскиваемыми далее миофиламентами остающимися нитями актина во время их движения (рисунок 3A, D, Кино 4). Мы проанализировали наши данные TIRFM более подробно, отследив единичные миофиламенты во время их направленного движения вдоль нити актина (рисунок 3B, (Роджерс и др., 2007)) и определив скорость от траекторий (Рисунок 3C, красная кривая). Одновременно, интенсивность флюоресценции в зеленом (актин), канале области, занятой миофиламентом во время его движения, была измерена, обнаруживая события поломки, как тянувшийся фрагмент приводит к увеличению флюоресценции, ближайшей к месту поломки (Рисунок 3C, сине-черная кривая). Скорость колеблется во время движения миофиламента вдоль нити актина (Рисунок 3C, красная кривая), посредством чего события ускорения (Рисунок 3C, красные стрелки) близко сопровождаются увеличением флюоресценции актина, указывая, что событие поломки имело место (Рисунок 3C, черные стрелы, сине-черная кривая). Мы выдвигаем гипотезу, что фазы увеличивающейся напряженности между концами миофиламента приводят к деформации нити актина и совпадают с уменьшением в скорости, в то время как фазы выпуска напряженности немедленно после поломки нити актина могут привести к ускорению миофиламента (рисунок 3C, D).

(Таблица 1 должна быть здесь)

Чтобы объяснить деформацию и возможную поломку нити актина, мы предлагаем следующую модель: нить миозина выравнивает параллельные нити актина и взаимодействует с нею через головки миозина ((Продавцы и Качар, 1990), рисунок 3D). Один конец миофиламента, который мы будем именовать как ‘ведущий конец’, ориентирован к плюс-концу актина (колючий конец), как нити в мышце, и может поэтому идти по нити актина, гидролизируя ATP (рисунок 3D). Другой конец миофиламента, который мы будем именовать как ‘тянущийся конец’, отделенный от ведущего конца голой зоной приблизительно 160 нм длиной (Аль-Хаят и др., 2010) без головок миозина, ориентирован в противоположном направлении. В то время как тянущийся конец все еще взаимодействует с нитью актина, ее противоположными результатами ориентации в намного более медленном направленном движении к плюс-концу актина (Spudich и др., 1985; Продавцы и Качар, 1990). Каждая головка миозина независимо следует за биохимическим циклом, состоящим из гидролиза ATP, связанного с актином, рабочий ход, сопровождаемый разобщением фосфата, разобщением ADP, закреплением ATP, и наконец отделением от актина ((Говард, 2001), рисунок 8). Мы предполагаем, что головки на тянущемся конце все еще взаимодействуют с нитью актина и проходят тот же самый цикл, но другие не выполняют шаги, которые привели бы к поступательному движению (вероятность создания шага pst=0), или делают шаги с маленькой вероятностью (pst=0.1). Когда головка миозина делает шаг (размер шага d = 5 нм (Говард, 2001)) он пытается переместить целую нить миозина к плюс-концу актина, но другие приложенные головки миозина сдерживают его, таким образом производя трение (рисунок 3D). Тянущийся конец миофиламента функционирует, главным образом, как источник трения (эффективный 'тормоз'), но также двигается силой натяжения плюс-конца, проявленной к ведущему концу (рисунок 3D). Так как, главным образом, ведущий конец активно перемещается, и тянущемуся конец пассивно тянут (pst=0) или способствует слабо только его собственному движению (pst=0.1), напряженность растет в пределах миофиламента и передается на нить актина как сила сжатия. Если достаточно высоко, эта сила сжатия может вызвать деформацию, и наконец, поломку нити актина (рисунок 3D). После поломки ведущий конец может переместиться беспрепятственно дальше к плюс-концу, таща прерванную часть нити актина, приложенной к тянущемуся концу (рисунок 3D). Тянущийся конец может также быть свойственен снова актину, и дальнейшие события поломки на той же самой нити могут следовать.

Чтобы оценить необходимую силу для разрушения нити актина, мы моделируем нити как гибкие пруты со сгибающейся жесткостью EI = 60 nN μm2, определенные с постоянной длиной актина: LP = EI / (kT) = 15 μm (Yanagida и др., 1984). Сила, необходимая для сгиба и поломки нити F = π2 EI/l2. С длиной l миофиламента голая зона 160 нм, что дает силу 23 pN. Может напряженность в пределах миофиламента достигать до этой силы? Мы выполнили моделирования этой модели, описав приложенную головку миозина как пружину с постоянной упругостью, равной ригидности головки миозина κ = 1 pN nm-1 (Kaya и Higuchi, 2010), и уравновесив все силы после каждого шага и каждого отделения головки миозина. От представления AFM миофиламента (рисунок 1C) и от известной структура миофиламента (Woodhead и др., 2005), мы оценили, что nm = 30 взаимодействующих головок миозина за нить. Результатом является чистое движение целого миофиламента к плюс-концу актина, с колеблющейся силой напряженности, скоростью и числом приложенных головок миозина, средние значения которых зависят от концентрации ATP (Рисунки 4A, B и 6). Мы отмечаем, что сила напряженности растет с уменьшением концентрации ATP, достигая сил, необходимых для поломки только в низкой (меньший, чем ∼3 мкм) концентрации ATP, в согласии с экспериментами (Рисунок 4A, видят также Таблицу 1). Когда нитям актина позволили согнуться в моделированиях в точке, где сгибающая сила 23 pN была достигнута (рисунок 4B), таким образом выпустив избыточную напряженность, кривизна нити постоянно увеличивается при низких концентрациях ATP, достигая критического искривления поломки 5.6 µm−1 ((Arai и др., 1999), рисунок 7A). При промежуточных концентрациях ATP искривление актина колебалось во времени, превышая порог искривления (Рисунки 4C и 7B). При более высоких концентрациях ATP пороговая сила была достигнута в слишком короткие периоды для нити, которая будет согнута к пункту поломки (Рисунки 4D и 7C). Результаты не зависят значительно от того, выполняют ли головки миозина на тянущемся конце шаги (pst=0.1) или нет (pst=0). Моделирования таким образом поддерживают идею, что в ряду концентрации ATP, используемом в экспериментах, различия во взаимодействиях перемещения и ведущих концах миофиламента с актином могут произвести силы сжатия на нити актина, и что эти силы достаточно высоки, чтобы согнуть и сломать нить актина.

Discussion

В нашей in vitro студии мы обеспечиваем потенциальный механизм, как оборот актина в клетках может быть установлен миофиламентом, который управляет фрагментацией актина. Чтобы согнуть и сломать нить актина, миофиламент должен быть присоединен к актину в течение достаточного количества времени, и достаточная сила должна быть произведена, требующая определенного среднего числа головок, привязанных к актину в любой момент времени. Учитывая небольшое количество взаимодействующих головок миозина, это переводит к требованию, чтобы большая часть головок была в связанном состоянии. В нашем испытании это было достигнуто с низкими концентрациями ATP. Заманчиво размышлять, что поломкой актина миофиламентами в естественных условиях управляет уровень ATP в клетке. Существуют недавние доказательства, что уровни ATP действительно изменяют значительно внутренние живые клетки (Imamura и др., 2009). Однако физиологические концентрации ATP, полученные из методов, которые обеспечивают усредненные уровни ATP без высокой пространственной и временной резолюции из извлечений клетки, обычно находятся в миллимолярном диапазоне (Beis и Newsholme, 1975). Здесь важно упомянуть, что миозин II скелетной мышцы (используемый в этом исследовании) имеет более низкий коэффициент заполнения и является поэтому менее поступательным, чем немышечный миозин в клетках (Харрис и Вошоу, 1993; Ван и др., 2003). Понижая концентрацию ATP в нашем испытании, мы увеличили коэффициент заполнения наших миофиламентов и таким образом сделали их более поступательными (дополнительный текст в ‘Материале и методах’, рисунок 5, Кино 5), подобно немышечному миозину, который соответствует предыдущим исследованиям (Хамфри и др., 2002; Смит и др., 2007; Соарес e Сильва и др., 2011). Кроме того, процессивность миофиламентов в клетках животных может также управляться фосфорилированием гирлянд миозина через другие белки, которые изменяют кинетические показатели биохимического цикла и таким образом увеличивают коэффициент заполнения миозинов, перемещающих наблюдаемое поведение в область высоких физиологических концентраций ATP (Загар и др., 1992; DeBiasio и др., 1996; Matsumura и др., 2001).

Наши моделирования показывают, что модель взаимодействия между актином и нитями миозина, описанная в тексте, правильно учитывает количественные значения параметров, известные из литературы (постоянные скорости). Самое главное она показывает, что достаточная сила, необходимая для сгибания и поломки нити актина, может быть произведена отдельным миофиламентом, приняв только различие во взаимодействии между продвижением и перемещением концов миофиламента (делающий шаг против не создания шага). Этот результат подразумевает, что присоединение ни актина, ни миозина к поддержке или любой другой жесткой конструкции не требуется для наблюдаемого процесса. Силы действуют в пределах отдельного миофиламента. Крепление нитей актина к мембране обеспечивает заключение нитей к плоскости, твердо не ограничивая нити поддержкой или лесами. Движение актина только ограничено эффективно более высокой вязкостью мембраны по сравнению с буферным раствором. Дальнейшее моделирование дает количественные данные модели, например, средние количества головок миозина в шести возможных состояниях (рисунок 9) и описывают колебания искривления нити актина (рисунок 4C, D). Другие параметры, которые могут быть получены из моделирований и могли быть по сравнению с новыми экспериментами, включают процессивность миозина как функции концентрации ATP и зависимость всеобщего поведения на длине миофиламентов.

В заключение, наши результаты показывают различные функции, которые движения миозина могут выполнять. В нашей минимальной системе, фрагмент миофиламента и компактный мембраносвязанный актин. Мы непосредственно показываем, что отдельные миофиламенты могут взаимодействовать с актином таким образом, при котором может быть произведена достаточная сила, чтобы сломать нить, без миофиламента или без актина, присоединенного основательно к твердой поддержке или лесам. Мы предполагаем, что фрагментация и уплотнение миофиламентов вносят в наблюдаемое крупномасштабное формирование рисунка сетей актомиозина также в другие in vitro системы (Backouche и др., 2006; Смит и др., 2007; Соарес e Сильва и др., 2011; Гордон и др., 2012). В естественных условиях поломка связок актина, как было показано, произошла в нейронных конусах роста в миозине II зависимым образом и, как полагаем, важна для переработки актина (Medeiros и др., 2006). Мы предполагаем, что наблюдаемая фрагментация и уплотнение мембраносвязанных нитей актина миозинами в нашей in vitro системе могли служить возможным общим механизмом для оборота актина и модернизации кортикального слоя клетки актина.

Material and methods

Details of the experiments

Традиционно, отдельные движения мышечного миозина II описаны как непоступательные движения (Говард, 2001). Собирая движения миозина в нити, миофиламенты становятся поступательными из-за сцепления более высокого числа головок миозина, которые находятся в контакте с нитью актина. В направленном движении нашей минимальной системы, сопровождаемом только фрагментацией нити актина, происходящей только при низких концентрациях ATP между 0.1-1 мкм (рисунок 3, Таблица 1, Кино 3). Более низкие концентрации ATP, как ожидают, увеличат продолжительность направляющегося актином состояния пострабочего хода головки миозина, таким образом увеличивая коэффициента заполнения и процессивности (Говард, 2001). Чрезвычайно низкие концентрации ATP, с другой стороны, не достаточны для моторной деятельности миозина. Чтобы проверить эффект концентрации ATP на процессивность, мы добавили Алекса-647, маркирующую миофиламенты к средней плотности MAC-ов и отслеживающую (Роджерс и др. 2007) движение отдельных миофиламент в низком (1 мкм) и высокой (4-миллиметровых) концентрациях ATP (рисунок 5, Кино 5). (Обратите внимание на то, что фрагментация и уплотнение нитей актина произошли только при низких концентрациях ATP). Сравнение траекторий показывает, что низкие траектории ATP в среднем более длинны, чем высокие траектории ATP, указывающие на более высокую процессивность при низких условиях ATP (рисунок 5, Кино 5). Кроме того, число отслеженных миофиламентов при низкой концентрации ATP со временем выдержки больше, чем 900 мс, было больше чем в шесть раз выше, чем при высокой концентрации ATP, предлагающей более высокий коэффициент заполнения на низких уровнях ATP (n = 681 в низкой ATP, n = 102 в высокой ATP; рисунок 5, Кино 5). Высокие концентрации ATP поэтому приводят к более быстрому отделению миофиламентов от нитей актина, чем при низких концентрациях ATP (Кино 5). Мы предполагаем, что увеличение процессивности из-за лишения ATP было необходимо для поступательного движения и предпосылки для фрагментации и уплотнения нитей актина.

Details of the model

Biochemical cycle

В модели взаимодействия миофиламент с актином мы предполагаем, что каждая активная головка миозина проходит следующий биохимический цикл, состоящий из шести главных состояний (Говард, 2001). Шесть состояний схематизированы на рисунке 8. Развязанная головка миозина с ATP (сост. 1) гидролизирует ATP с уровнем k1 = 100 s-1(сост. 2), связывается с нитью актина с уровнем k2 = 30 s-1 (сост. 3), быстро выпускает фосфат, осуществляя рабочий ход с уровнем k3 = 104 s-1 (сост. 4), выпускает ADP с уровнем k4 = 1000 s-1 (сост. 5), связывает ATP с уровнем k5 = kt [ATP], где kt = 4 μM−1 s-1, (сост. 6), и отделяют от нити актина с уровнем k6 = 2000 s-1 (сост. 1). Эти показатели определяют среднее время, которое головки миозина проводят в каждом состоянии (рисунок 9). В этой простой модели показатели, как предполагается, независимы от растяжения головки миозина. Размер шага миозина d = 5 нм (Говард, 2001). Головки миозина продвижения конца миофиламента всегда выполняют шаг в результате рабочего хода между состояниями 3 и 4. Головки тянущегося конца каждая не делает шаг (вероятность создания шага pst=0), или, в отдельных моделированиях, делают шаг с вероятностью pst=0.1. Это значение основано на наблюдениях, которые тянущийся конец миофиламента проходит вдоль актина с приблизительно в десять раз более медленной скоростью, чем ведущий конец (Продавцы и Качар, 1990).

Mechanical equillibrium

Каждая головка миозина была свойственна нити актина, описана как пружина с постоянной упругостью, равной ригидности головки миозина κ = 1 pN nm-1 (Kaya и Higuchi, 2010). После каждого шага и после каждого отделения головки миозина, силы уравновешиваются движением миофиламента вдоль нити актина. Результатом является чистое движение целого миофиламента к плюс-концу актина, с колеблющейся силой напряженности, скоростью и числом приложенных головок миозина, средние значения которых зависят от концентрации ATP.

Number of myosin heads on the myofilament

Средняя длина миофиламента, определенного с AFM, составляла 560 нм (рисунок 1C). Предполагая, что длина голой зоны без головок миозина в центральной части миофиламента 160 нм (Аль-Хаят и др., 2010), оба конца миофиламента 200 нм длиной. С четырьмя парами головок миозина вокруг длина окружности миофиламента через каждые 14.5 нм (Woodhead и др., 2005), на каждом миофиламенте есть в среднем 110 главных пар. Предположим далее, что только те головки, ориентированные к одной стороне, то есть, одной четверти, могут взаимодействовать с нитью актина, и что только одна головка главной пары благоприятно ориентирована, чтобы взаимодействовать, мы оцениваем среднее число взаимодействующих головок как 30 на миофиламент.

Buckling force

Чтобы оценить силу, необходимую для сгибания нити актина, мы моделируем его как гибкий прут со сгибающейся жесткостью EI = 60 nN μm2, определенный с постоянной длиной актина: LP = EI / (kT) = 15 μm (Yanagida и др., 1984). Сила, необходимая для сгибания и поломки нити F = π2 EI/l2. С длиной l голая зона миофиламента 160 нм, это дает силу 23 pN. Нити актина ломаются, когда радиус кривизны нити склонности опускается ниже 0.18 μm (Arai и др., 1999), соответствую искривлению 1/r = 5.6 μm-1.

Results of the simulations

Чтобы узнать, может ли напряженность в пределах миофиламента, переданного на нить актина как сила сжатия, стать достаточно высокой, чтобы согнуть и сломать нить актина, мы выполнили два типа моделирований.

В первом случае изгиб нити не был позволен, и никакой предел не был наложен на силу сжатия в пределах нити актина. Это позволило нам определять силы, которые могут быть достигнуты этой моделью. Во втором случае нити актина позволили согнуться, когда сила 23 pN была превышена. Изгиб актина был смоделирован, уменьшая расстояние между продвижением и перемещением концов миофиламента, таким образом ослабление напряжения и сокращение силы вниз к 23 pN.

В случае, когда изгиб не был позволен, средняя сила увеличилась с уменьшением концентрации ATP, и также с растущим числом головок миозина (рисунок 4A). Для 30 головок миозина сила 23 pN, необходимая для сгибания нити, могла быть достигнута при концентрациях ATP приблизительно 3 мкм или ниже (рисунке 4A).

В ряду концентрации ATP, используемом в экспериментах здесь (<100 µM, см. также Таблицу 1), средняя скорость миофиламента увеличилась приблизительно линейно с концентрацией ATP, независимо от числа голов миозина, или факта, был ли изгиб актина позволен или не (рисунок 6A). Средняя часть голов миозина была свойственна актину, увеличенному с уменьшением концентрации ATP (рисунок 6B), и так как выступление глав миозина друг независимо от друга и вовлеченных сил, было также независимо от числа голов миозина и изгиба актина.

Когда нити актина позволили согнуться, максимальной силе не разрешили превысить 23 pN (рисунок 4B). При низкой концентрации ATP произведенная сила была достаточно высока, чтобы непрерывно сгибать нить актина, постоянно увеличивая искривление выше порога поломки (рисунок 7A). При промежуточных концентрациях ATP сила, колеблющаяся около порога, вызвала колебания в искривлении во времени, превысив порог искривления и затем ослабившись снова к прямой конфигурации нити (Рисунки 4C и 7B). При еще более высоких концентрациях ATP пороговая сила была достигнута слишком короткие периоды для достаточно высокого искривления, чтобы развить (Рисунки 4D и 7C).

Результаты для сценария, где головки миозина тянущегося конца могут сделать шаг к плюс-концу актина с вероятностью pst=0.1, очень подобны тем с pst=0. Различия в том, что произведенные силы немного ниже (рисунок 4A, B) и средняя скорость немного выше (рисунок 6A).

Actin preparation and labeling

Мономеры актина скелетной мышцы кролика (Молекулярные Исследования) и биотинилированные мономеры актина кролика (tebu-bio [Cytoskeleton Inc.]) были смешаны в отношении 5:1 (actin:biotin-aktin). Полимеризация смеси (39.6 мкм) была вызвана в F-буфере, содержащем 50-миллиметровый KCl, 2-миллиметровый MgCl2, 1-миллиметровый DTT, 1-миллиметровую ATP, 10-миллиметровый буфер Тris-HCl (pH фактор 7.5). Биотинилированные нити актина были маркированы Alex-флюоритом-488 Фаллоидин ом (Молекулярные Исследования) согласно протоколу изготовителя. Наконец, 2 мкм (относится к мономерам) маркированных биотинилированных нитей актина Алекс-488-Фаллоидин были получены.

Myosin preparation and labeling

Миозин был очищен от ткани скелетной мышцы кролика, как ранее описано (Смит и др., 2007). Активность миозина была проверена классическим испытанием подвижности, где миозины, связанные с покрытой нитроцеллюлозой стеклянной поверхностью опрыскивающей камеры (tebu-bio [Cytoskeleton Inc.]), продвигают нити актина. Движение нитей актина указало на целостность движений миозина (данные, не показанные). Собрание миофиламентов было вызвано в буфере реакции, содержащем 50-миллиметровый KCl, 2-миллиметровый MgCl2, 1-миллиметровый DTT и 10-миллиметровый буфер трижды-HCl (pH фактор 7.5), и в зависимости от экспериментов различные суммы восстановленной ATP и кислородной очищающей системы. Уравновешивание смеси в течение приблизительно 30 минут дало нам среднюю длину 560 нм в нашей системе (рисунок 1C).

Миозины были маркированы тиол -реактивными красками Алекс-Флуор-488 C5-малеимида, а также Алекс-Флуор-647 C2-малеимида (оба Молекулярных Исследования). Реакции маркировки были выполнены в небольшом изменении согласно протоколу изготовителя. Короче говоря, тиол-реактивные краски были разведены в диметилсульфоксиде к 10-миллиметровой концентрации и хранились при −80°C. Запас миозина (14.99 мкм в 50%-м глицерине) был растворен к 2 мкм в буфере реакции, содержащем 50-миллиметровый KCl, 10-миллиметровый буфер трижды-HCl (pH фактор 7.5) и 2-миллиметровый MgCl2. Раствор был деоксигирован в течение 15 минут под вакуумом и помещен в среду N2. 15-кратный молярный избыток (30 мкм) TCEP (тримараны (2- карбоксиэтил) фосфин, Молекулярные Исследования) был добавлен к раствору и выведен в течение 1 часа при комнатной температуре. 25-кратный молярный избыток для достижения 50 мкм красок малеимида был добавлен капля по капле к раствору, в то время как это размешивалось и выводилось быстро при 4°C. Маркированные миофиламенты были отделены от остающихся красок фильтрацией геля, чтобы получить 1 мкм (относится к отдельным миозинам), маркированных миофиламентов. Деятельность маркированных миозинов была подтверждена подвижностью и испытанием формирования рисунка актина. Определенные количества были заморожены и сохранены при −80 °C.

MAC (Minimal actin cortex) preparation

Для подготовки MAC-а камера, состоящая из укороченной 1.5 мл трубы Эппендорфа, приклеенная к стеклянной поверхности, очищенной воздушной плазмой (22 × 22 мм, № 1.5, Мензель Глэзер, Термо Фишер, Брауншвейг, Германия) был построен. Для плоских, поддерживаемых стеклом мольных отношений формирования двойного слоя липида липидов (?!) PC Egg (99.99, 99.9 и 99% молекулярной массы) и PEG (2000) - Биотин (0.01, 0.1 и 1% молекулярной массы) были растворены в хлороформе (полные 10 мг/мл липидов), высушены под потоком азота в течение 30 минут и впоследствии помещены в вакуум в течение 30 минут. Липиды тогда повторно гидратировались в буфере реакции, содержащем 50-миллиметровый KCl, 2-миллиметровый MgCl2, 1-миллиметровый DTT и 10-миллиметровый буфер трижды-HCl (pH фактор 7.5), и повторно приостанавливались энергичным вращением. Чтобы получить SUV-ов (небольшие однослойные пузырьки), суспензия была открыта для воздействия ультрахвуком в водяной бане при комнатной температуре. 10 мкл суспензии были смешаны с буфером реакции на 90 мкл и поместили на стеклянную поверхность камеры. CaCl2 к заключительной концентрации 0.1 мм был добавлен, чтобы вызвать сплав SUV-ов и формирование двойного слоя липида на стеклянной поверхности. Образец несколько раз промывался с суммарным объемом буфера реакции на приблизительно 2 мл, чтобы удалить несплавленные пузырьки. После мытья 2 мкг нейтравидина (Молекулярные Исследования) разведенные в буфере реакции на 200 мкл были добавлены к образцу и выведены при комнатной температуре в течение 10 минут. Образец несколько раз промывался с > 2 мл реакцией буфера для удаления несвязного нейтравидина. Тогда 10-50 мкл 2-ух мкм (относится к мономерам) Алекс-488-фаллоидина маркировали биотинилированные нити актина, были добавлены к двойному слою липида и выведены в течение 1 часа. Образец был тщательно промыт с буфером реакции на приблизительно 1-2 мл, чтобы удалить несвязные нити актина.

Actin fragmentation and pattern formation assay

Алекс-647 (и Алекс-488) маркировала миофиламенты и/или немаркировала миофиламенты различных концентраций (как обозначено) разведенные в буфере реакции на 200 мкл, были добавлены к MAC и отражены микроскопией TIRF. Буфер реакции содержал ATP на 0.1-1 мкм (см. также Таблицу 1), система регенерации ATP, состоящая из 20-миллиметрового фосфата Креатина (Сигма) и 0.1 мг ml−1. Креатин фосфо киназа (Сигма) нужен для сохранения концентрации ATP постоянной, а очищающая кислородная система (оксидаза глюкозы (165 U ml−1) каталаза (2,170 U ml−1), β-D-глюкоза (0.4% wt/vol) и тролокс (2 мм), все от Сигмы) - для уменьшения фотоотбеливания красок Алексы. Перестановки актина и фрагментация немедленно произошли после добавления миофиламентов.

TIRF microscopy

Двухцветная микроскопия TIRF была выполнена на изготовленной на заказ установке, построенной вокруг микроскопа Axiovert 200 (Zeiss), для рассмотрения деталей (Свободный и др., 2011). Масляная иммерсионный объектив Альфа Plan-Apochromat-а для 100×/NA 1.46 и лазерные линии на 647 нм и на 488 нм использовались для возбуждения маркированных исследований. Времена воздействия составляли или 50 мс, или 100 мс, и временные интервалы между каждой зарегистрированной структурой колебались с 200–400 мс для различных экспериментов.

AFM imaging

Атомная силовая микроскопия была выполнена, используя систему NanoWizard AFM (Инструменты JPK, Берлин, Германия). Головка AFM была установлена сверху стабильного чугунного предметного столика микроскопа и объединена с софокусным микроскопом LSM 510 (Карл Зейсс, Йена, Германия). Использовались мягкие, прямоугольные кремниевые кронштейны (CSC38/noAl, Микромесиво, Tallin, Эстония) с номинальной постоянной упругости 0.03 Н/м. Чувствительность кронштейнов в V/m была определена перед каждым измерением. Постоянная упругости была калибрована при помощи теплового метода колебаний. Чистые, круглые стеклянные поверхности (d = 24 мм, № 1.5, Мензель Глэзер, Термо Рыбак, Брауншвейг, Германия) были гидрофилизированы воздушной плазменной очисткой. Жидкая клетка AFM была собрана при помощи предметного стекла и заполнена 400 мкл буфера реакции. Непосредственно перед отображением AFM, миофиламенты были разбавлены буфером реакции к концентрации 10 нм. 5 мкл 10-ти нм миофиламентов в буфере реакции были добавлены к жидкой клетке. В экспериментах с объединенным AFM и отображении флюоресценции, использовались маркированные миофиламенты Алекс-488. После 15-минутной инкубаций большинство миофиламентов придерживалось гидрофильньной поверхности, остаточные нелипкие нити были удалены, промываясь с буфером реакции. Отображение AFM было выполнено в контактном режиме с частотой сканирования 1 Гц. Силы отображения были сохранены очень низкими (< 0.5 nN), непрерывно регулируя отклонение точки установки и используя оптимизированные коэффициенты обратной связи. Сырые изображения AFM были линейно и плоскостно приспособленны при помощи общедоступного программного обеспечения Gwyddion (www.gwyddion.net).

Myofilament length determination

Гистограммы длины миофиламентов были получены из софокусных изображений маркированных Алекс-488 миофиламентов, подготовленных, как описано в секции отображения AFM. Софокусная микроскопия была выполнена, используя LSM 510 Meta System (Карл Зейсс, Йену, Германия) с 40× водно-иммерсионным объективом (C-Apochromat, 40×/1.2, Карл Зейсс). Линия на 488 нм лазера Иона аргона использовалась, чтобы воздействовать на образец. Возбуждение флюоресценции и эмиссия были отделены, используя встроенное в микроскоп дихроическое зеркало (HFT 488/633) и фильтр полосы пропускания (BP 505–550) перед датчиком. Измерение длины миофиламента изображений AFM было вручную выполнено с помощью программного обеспечениея Gwyddion. Распределение длины миофиламента софокусных изображений с xy-размером-пикселя 110 нм было получено вручную, используя Изображение J. Точность определения длины, основанная на софокусной микроскопии, была проверена колокализацией с изображениями AFM. Идентичные длины нитей были получены, используя оба метода (r Пирсона = 0.99, n = 47) и поэтому оправдали большие измерения, используя софокусную микроскопию.

Data analysis

Анализ данных был выполнен c помощью Image J (Rasband, W.S., Национальные Институты Здоровья, США, http://imagej .nih.gov/ij) и сторонними написанными скриптами в IGOR Pro 6.0 (WaveMetrics, Лейк-Осуэго, США) и MatLab. Измерение длины нити актина (рисунок 2B) было выполнено, используя плагин NeuronJ J для Image J, для рассмотрения деталей (Meijering и др., 2004). Профили интенсивности флюоресценции для рисунка 2D, E (главный текст) были получены, используя сегментированный инструмент линии и профильную команду графика по Image J. Чтобы определить интенсивность флюоресценции в области, занятой маофиламентом (рисунок 3C [главный текст]) использовался сторонний написанный макрос для Image J. Короче говоря, последовательность изображения в канале на 647 нм Алекс-647 маркировала миофиламенты (красным), была преобразован в 8 битов, бинаризирована при помощи порогового фильтра, и был создан выбор области (соответствующиего миофиламента) для каждого бинарного изображения. Средняя интенсивность флюоресценции по соответствующим изображениям канала на 488 нм Алекс-488-фаллоидина маркированные нити актина (зелеными), была вычислена в отобранной области. Сглаживание профилей интенсивности на рисунке 3C проводилось, используя алгоритм сглаживания со скользящим средним (интервал 2 с), осуществленный в IGOR Pro.



Миофиламенты для скоростного анализа были прослежены, используя сторонню программу, написанную Роджерсом и др. (для получения дополнительной информации посмотрите (Роджерс и др., 2007)). Радиальная скорость vt была вычислена из траекторий миофиламента xt, yt, где t является дискретным временем выборки с интервалом Δt = 0.2 с. Радиальное изменение в положении было вычислено Δrt = ((xt+nΔt − xt)2 + (yt+nΔt − yt)2)1/2. Окружная скорость была получена из vt = Δrt/nΔt. Интервалы вычисления nΔt с n = 20 были выбраны, чтобы уменьшить шум, вызванный маленькими колебаниями в положениях.

Коьрта
Контакты

    Главная страница


Кортикальный слой кора in vitro искусственно, в пробирке

Скачать 232.73 Kb.