• Саратов 2009
  • МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Определение массовой доли белка методом Кьельдаля

  • Скачать 424.78 Kb.


    страница1/2
    Дата17.01.2018
    Размер424.78 Kb.
    ТипМетодические указания

    Скачать 424.78 Kb.

    Методические указания к выполнению лабораторной работы по курсу «Технология пищевых производств» для студентов специальности 260601. 65


      1   2

    Министерство образования и науки Российской Федерации
    Федеральное агентство по образованию
    Саратовский государственный технический университет
    методы Определения БЕЛКОВ

    в пищевых продуктах

    Методические указания

    к выполнению лабораторной работы

    по курсу «Технология пищевых производств»

    для студентов специальности 260601.65




    Одобрено

    редакционно-издательским советом

    Саратовского государственного технического университета


    Саратов 2009

    Цель работы: изучение методов определения белковых веществ в пищевых продуктах.

    ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ
    Среди азотистых веществ, входящих в состав пищевых про­дуктов, важнейшая роль принадлежит белкам.

    Белками или белковыми веществами называются сложные высокомолекулярные полимеры, молекулы которых построены из остатков аминокислот.

    Аминокислота – это гетерофункциональное соединение. Простейшая формула аминокислоты: R-CH-COOH-NH2-. -NH2 – аминогруппа, обладает основными свойства белков; -COOH – карбоксильная группа – обладает кислотными свойствами; R – радикал, влияет на пространственную конфигурацию молекул белка. Остатки аминокислот в молекуле белка соединяются при помощи полипептидной связи – CO-NH-. Белки наиболее важные и сложные по химической структуре среди веществ, входящих в пищевые продукты. Полипептидные цепи белков строятся из десятков и сотен молекул, причем не одной, а разных аминокислот, образуя цепь они могут соединяться в различной последовательности, что приводит к огромному многообразию комбинаций аминокислотных остатков в полипептидных цепях.

    Состав белков: содержание углерода – 50-55%; водорода – 6,5-7,3%; кислорода – 21,5-23,5%; азота – 15-18%. Также в состав белков входит селен, фосфор.

    Классификация белков:


    1. в зависимости от формы молекулы белка: глобулярные и фибриллярные;

    2. по строению: простые (протеины) – при гидролизе распадаются до аминокислот и сложные (протеиды) – при гидролизе распадаются на аминокислоты и простетическую группу;

    3. по растворимости: растворимые и не растворимые в солевых растворах;

    4. по выполняемым функциям: белки выполняют каталитические функции (ферменты); регуляторные (гормоны); структурные (коллаген); двигательные; транспортные (гемоглобин); защитная (иммуноглобулин).

    Их основное зна­чение заключается в незаменимости другими компонентами пи­щи. Белки составляют основу процессов жизнедеятельности орга­низма. Необходимость их постоянного обновления лежит в осно­ве обмена веществ.
    Белки в организме выполняют структурную (построение тка­ней и клеточных компонентов) и функциональную (ферменты, гормоны, дыхательные пигменты и др.) роль.

    Дефицит белка в пищевом рационе повышает восприимчи­вость организма к инфекционным заболеваниям, нарушает про­цессы «кроветворения», обмен липидов, витаминов и др. У детей при белковой недостаточности замедляются рост и умственное развитие.

    Длительный избыток белка в питании также отрицательно сказывается на жизнедеятельности организма, вызывая перевозбудимость нервной системы, нарушение обменных процессов, пе­регрузку печени и почек.

    В ежедневном рационе взрослого человека белки должны со­ставлять около 14% общей калорийности, сочетаясь в определен­ном соотношении с другими пищевыми веществами.

    Известно, что растительные белки усваиваются организмом не полностью по сравнению с животными. Так, белки молока и яиц усваиваются на 96%, белки рыбы и мяса – на 95%, белки хлеба из муки пшеничной I и II сортов — на 85%, белки карто­феля, хлеба из обойной муки, бобовых — на 70%. Учитывая, что растительные белки менее полноценны по составу незаменимых аминокислот, чем животные, потребление определенного количе­ства животных белков совершенно необходимо. Для взрослого человека доля животных белков в среднем должна составлять около 55% общего количества белка в рационе.

    Технологические свойства белков.



    1. Белки – амфотерные соединения. При определенном значении ph=4,6-4,7 (изоэлектрическая точка белка) число положительных и отрицательных зарядов одинаково. Белки в данной точке электронейтральны, а их растворимость и вязкость наименьшая. Эту способность белка снижать растворимость при достижении электронейтральности широко используют в пищевой промышленности, например при производстве сыра и творога.

    2. Гидратация белков. Белки присоединяют воду, то есть проявляют гидрофильные свойства, при этом они набухают, увеличивается их масса и объем, причем набухание может сопровождаться частичным растворением белков. На поверхности молекулы белка содержаться группы: карбоксинальная, аминная, пептидная, эти группы притягивают к себе молекулы воды и образуют защитную гидратную оболочку. В результате молекулы белков не могут соединяться друг с другом, то есть агрегироваться. В изоэлектрической точке данная оболочка разрушается, молекулы белков соединяются друг с другом, а эти агрегаты могут выпадать в осадок. При изменение среды макромолекулы белков становятся заряженными, их способность присоединять воду меняется, при ограниченном набухании белковые растворы образуют сложные смеси, называемые студнями. Набухший в воде белок пшеничной муки образует клейковину. Студни и клейковина обладают свойствами упругости и эластичности, пластичности и ползучести, т.е. свойствами твердого и жидкого тела. Свойство набухания играет большую роль в пищевой технологии (набухание зерна при замочке, муки при замесе теста).

    3. Денатурация – это изменение пространственной ориентации белковой молекулы, не сопровождающееся разрывом ковалентных связей. Денатурация может вызываться повышением температуры, механическим и химическим воздействием, ультразвуком, ионизирующим облучением и другими факторами. При этом процессе изменяются физические свойства белка: уменьшается способность к гидратации, снижается растворимость, теряется его биологическая активность, меняется форма макромолекулы. Денатурация белков играет важную роль в технологических процессах, связанных с образованием структурных систем полуфабрикатов и готовых продуктов (хлеба, макаронных, кондитерских и других изделий).

    4. Гидролиз белков. Протекает под действием ферментов ступенчато с образование промежуточных продуктов: пептонов, полипептидов, дипептидов, аминокислот. Процесс присоединения группы – OH- к карбоксильной группе.

    5. Пенообразование – способность белков образовывать эмульсии в системе жидкость-газ, называемые пенами. Белки как пенообразователи широко используются при изготовлении многих кондитерских изделий.

    6. Меланоидинообразование – это свойство объясняется взаимодействием аминогруппы белка с карбонильными группами сахаров. Эта реакция сопровождается образованием меланоидинов, то есть веществ, обладающих различным окрашиванием и ароматом.

    Массовую долю белка в пищевых продуктах определяют по количеству общего азота методом Кьельдаля. С развитием фото- и спектрофотометрии были разработаны методы количественного определения белка, основанные на его способности давать окра­шенные соединения с некоторыми реагентами. Среди них следует отметить метод Лоури, биуретовый метод. Находят применение также физико-химические методы, в основу которых положены специфические свойства белка: образование различной степени помутнения в зависимости от концентрации белка в растворе сульфосалициловой кислоты (нефелометрический метод), способ­ность белка адсорбировать некоторые красители и другие свойства белка.

    Все перечисленные методы могут быть отнесены к ускорен­ным. При относительно небольших затратах времени они харак­теризуются достаточно высокой точностью и простотой определе­ния. В настоящих методических указаниях изложены методы количест­венного определения белка: Кьельдаля, биуретовый, нефелометрический, рефрактометрический и метод формольного титрования.


    МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
    Определение массовой доли белка методом Кьельдаля
    Метод основан на минерализации навески продукта при нагревании с концентрированной серной кислотой в присутствии катализато­ров. При этом углерод и водород органических соединений окис­ляются до диоксида углерода и воды, азот, освобождаемый в ви­де аммиака, соединяется в колбе с серной кислотой, образуя сульфат аммония. Схематично происходящие реакции могут быть представлены следующим образом:

    RCHNH2COOH +H2SO4 =СО2+ SO2 + H2O + NH3.


    2NH3+ H2SO4—(NH4)2SO4.

    На последующей стадии дистилляции раствор сульфата ам­мония обрабатывают концентрированным раствором гидроксида натрия, при этом аммиак освобождается и улавливается титро­ванным раствором серной кислоты. Избыток серной кислоты оттитровывают раствором гидроксида натрия. Метод Кьельдаля применяют в нескольких модификациях, отличающихся в основ­ном условиями минерализации. Для ускорения процесса вводят различные катализаторы: оксид меди, селен, свинец и другие, повышают температуру кипения серной кислоты добавлением со­лей, сульфата калия или натрия, сочетают добавление катализа­тора и солей при сжигании навески.

    Методом Кьельдаля в любой модификации определяется ко­личество общего азота. Массовая доля белка вычисляется умно­жением полученной величины общего азота на переводной коэф­фициент 6,25, исходя из того, что в белках в среднем содержится 16% азота. Условность полученных результатов при таком пере­счете очевидна, так как не весь азот пищевого продукта находит­ся в форме белка и, кроме того, процентное содержание азота в белках подвержено колебаниям как в сторону повышения, так и в сторону понижения от 16%. В некоторых продуктах азотистые вещества небелкового характера достигают значительных коли­честв (мышечная ткань рыбы – 15%, мясо животных – 10–16% от общего количества азотистых веществ).

    Следовательно, для получения более точных результатов не­обходимо либо при пересчете общего азота на белок использо­вать различные коэффициенты в зависимости от процентного со­держания азота в белках отдельных продуктов: мясо и овощи – 6,25; пшеница, рожь, горох и др. – 5,7; гречиха, рис – 6,0; моло­ко – 6,37 и т. д., либо белковый азот определять отдельно специ­альными методами.


    Техника определения
    В колбу Кьельдаля помещают последовательно несколько стеклянных бусинок или кусочков фарфора, около 10 г серно-кислого калия, 0,04 г серно-кислой меди. В бюксу с крышкой отмеривают 5 см3 молока, крышку закрывают и взвешивают. Молоко из бюксы переливают в колбу. Пустую бюксу вновь взвешивают и по разнице между массой бюксы с молоком и массой пустой бюксы устанавли­вают массу взятого молока. В колбу добавляют 20 см3 серной кислоты, вливая осторожно по стенкам колбы, смывая с них капли моло­ка. Колбу закрывают грушеобразной стеклянной пробкой и осторожно круговыми движениями перемешивают содержимое колбы.

    Колбу ставят на нагревательный прибор в наклонном положении под углом 45° и осторожно нагревают.

    Продолжают нагревание колбы до тех пор, пока не прекратится пенообразование и содержимое колбы не станет жидким.

    Затем сжигание продолжают при более интенсивном нагрева­нии. Степень нагревания считают достаточной, когда кипящая кис­лота конденсируется в середине горловины колбы Кьельдаля.

    Время от времени содержимое колбы перемешивают, смывая обуглившиеся частицы со стенок колбы. Нагревание продолжают до тех пор, пока жидкость не станет совершенно прозрачной и прак­тически бесцветной (при применении в качестве катализатора оки­си ртути) или слегка голубоватой (при применении и качестве катализатора серно-кислой меди).

    После осветления раствора нагревание продолжают в течение 1,5 ч, после чего колбе дают остыть до комнатной температуры. Добавляют

    150 см3 дистиллированной воды и несколько кусочков свежепрокаленной пемзы, перемешивают и снова охлаждают.

    В коническую колбу отмеривают 50 см3 раствора борной кисло­ты, добавляют 4 капли индикатора и перемешивают. Коническую колбу соединяют с холодильником с помощью аллонжа и резино­вой пробки так, чтобы конец аллонжа был ниже поверхности раствора борной кислоты в конической колбе. Колбу Кьельдаля соеди­няют с холодильником при помощи каплеуловителя, проходящего через одну пробку с делительной воронкой. Градуированным ци­линдром отмеривают 80 см3 раствора гидроокиси натрия (при при­менении в качестве катализатора красной окиси ртути используют раствор гидроокиси натрия, содержащий сульфид натрия) и через делительную (или капельную) воронку вносят его в колбу Кьельдаля. Сразу же после выливания раствора закрывают кран делительной воронки для избежания потери образующегося аммиака.

    Содержимое колбы Кьельдаля осторожно смешивают круговы­ми движениями и нагревают до кипения. При этом необходимо избегать пенообразования.

    Продолжают перегонку до тех пор, пока жидкость не начнет вскипать толчками. При этом регулируют степень нагрева так, чтобы время дистилляции было не менее 20 мин. Убедиться в полноте перегонки аммиака можно путем дополнительной перегонки в новую порцию борной кислоты (20 см3) в течение 5 мин. Окраска раствора борной кислоты должна оставаться без изменения. При перегонке не допускают нагревание раствора борной кислоты в конической колбе. Слишком сильное охлаждение (ниже +10 °С) также нежелательно, так как оно может вызвать переброс жидкости из конической колбы в колбу Кьельдаля.

    Перед окончанием перегонки опускают коническую колбу так, чтобы конец аллонжа оказался над поверхностью раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2 мин.

    Прекращают нагревание и отсоединяют аллонж. В коническую колбу смывают внешнюю и внутреннюю поверхности аллонжа не­большим количеством дистиллированной воды.

    Титруют дистиллят раствором соляной кислоты до перехода зе­леного цвета в серый. При избытке титранта раствор приобретает фиолетовый цвет.

    Параллельно проводят контрольный анализ так же, как и основ­ной, применяя 5 см3 дистиллированной воды вместо молока. Коли­чество повторностей контрольного анализа должно быть не ме­нее 5. Контрольный анализ проводится в каждой серии определе­ний количества белка и при каждой замене реактивов.


    Проведение ускоренного анализа
    В кварцевую пробирку помещают компоненты, указанные в пер­вом абзаце. Осторожно круговыми движениями перемешивают содержимое пробирки. Затем вносят в пробирку 20 см3 перекиси водорода, не допуская вспенивания.

    Пробирку ставят в гнездо алюминиевого блока, помещенного на электроплитку. Устанавливают регулятор нагрева плитки в среднее положение. После прекращения вспенивания содержимого пробирки устанавливают регулятор нагрева плитки в положение, соответству­ющее максимуму. Нагревание продолжают до тех пор, пока жид­кость не станет прозрачной и бесцветной или слегка голубоватой. Затем пробирку охлаждают и присоединяют к перегонному аппара­ту (рис. 1).



    Рис. 1. Прибор для отгонки аммиака:

    1 – плитка электрическая; 2 – колба коническая вместимостью 2000 см3; 3 – воронка делительная; 4 – каплеуловитель; 5 – пробирка кварцевая; 6 – холодильник; 7 – колба коническая вместимостью 250 см3
    В коническую колбу вместимостью 250 см3 отмеривают мерным цилиндром 20 см3 раствора борной кислоты, добавляют 3-4 капли раствора двойного индикатора.

    Отмеривают мерным цилиндром 60 см3 раствора гидроокиси на­трия и осторожно, не допуская выбросов, переливают его через де­лительную воронку в пробирку. Кран воронки сразу закрывают. Открывают зажим на линии подачи пара из конической колбы вмес­тимостью 2000 см3 и направляют пар в пробирку.

    Перегонку ведут до достижения объема конденсата от 50 до 70 см3.

    Конденсат титруют раствором соляной кислоты до перехода зе­леного цвета в серый. При избытке титранта раствор приобретает фиолетовый цвет.


    Параллельно проводят контрольный анализ, используя вместо молока 5 см3 дистиллированной воды.

    Массовую долю белка X в процентах вычисляют по формуле:



    ,

    где 1,4 – количество азота, эквивалентное 1 см3 раствора соляной кислоты с молярной концентрацией с (HCl)=0,1 моль/дм3, мг/см3; N – коэффициент, численно равный величине молярной концентрации раствора соляной кислоты, выраженный мг/см3; V1 – объем раствора соляной кислоты, израсходованный на титрование дистиллята в основном анализе, см3;

    V0 – объем раствора соляной кислоты, израсходованный на титрование дистиллята в контрольном анализе, см3; 6,38 – коэффициент пересчета массовой доли общего азота на массовую долю общего белка; m – масса молока, взятая на анализ, г.

    За окончательный результат испытания при анализе по Кьельдалю принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 0,03%.


      1   2

    Коьрта
    Контакты

        Главная страница


    Методические указания к выполнению лабораторной работы по курсу «Технология пищевых производств» для студентов специальности 260601. 65

    Скачать 424.78 Kb.