• ЧАСТЬ 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКОВ и нуклеиновых кислот
  • И.М. Швец УДК 577.2(076.5) ББК Е07-5я73 © Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, 2015
  • ВВЕДЕНИЕ
  • ЛИТЕРАТУРА
  • 1. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 1.1. Определение концентрации белков
  • Выбор метода определения белка
  • Спектрофотометрический метод.
  • Анализ белка методом Лоури.
  • Анализ на основе бицинхониновой кислоты .
  • Анализ белков методом Брэдфорда.
  • 1.2. Электрофорез в полиакриламидном геле Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ)
  • Концентрация акриламида (%) Разрешение геля ( kD )
  • 1.3. Электрофорез в агарозном геле
  • Длина нуклеотидной последовательности молекул НК.
  • Физико-химические характеристики электрофореза.
  • 2. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ЗАНЯТИЕ № 1. Определение концентрации белка методами Брэдфорда и спектрофотометрии Целью работы
  • ВАЖНО!
  • ЗАНЯТИЕ № 2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле Целью работы
  • Необходимое оборудование
  • Нижний гель Компоненты раствора
  • Верхний гель Компоненты раствора
  • ЗАНЯТИЕ № 3. Иммуноблот Целью работы
  • Пособие к практическим занятиям по молекулярной биологии. ЧАСТЬ 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
  • Касатова

  • Скачать 329.3 Kb.


    Дата17.01.2018
    Размер329.3 Kb.
    ТипУчебно-методическое пособие

    Скачать 329.3 Kb.

    Полимеразная цепная реакция (пцр) — метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты



    МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

    РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ



    Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

    Пособие к практическим занятиям по молекулярной биологии.

    ЧАСТЬ 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКОВ и нуклеиновых кислот

    Учебно-методическое пособие

    Рекомендовано методической комиссией

    Института биологии и биомедицины

    для студентов ННГУ,

    обучающихся по направлению подготовки

    06.03.01 «Биология».

    Нижний Новгород

    2015

    УДК 577.2(076.5)

    ББК Е07-5я73

    П62
    П 62 Пособие к практическим занятиям по молекулярной биологии. Часть 3. Исследование физико-химических свойств белков и нуклеиновых кислот: Учебно-методическое  пособие. Авторы: Е.С. Касатова, Л.Б. Луковникова, С.Г. Фомина,  Е.Н. Горшкова, Е.А. Василенко, А.В. Калугин, Д.В. Новиков, А.Д. Перенков, И.В. Астраханцева, В.В. Новиков. – Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского, 2015. – 19 с.

    Рецензент: к.б.н., доц. Варшавская Л.В.

    Пособие предназначено для студентов старших курсов биологического факультета, обучающихся по направлению подготовки 06.03.01 «Биология», изучающих молекулярную биологию и выполняющих практические задания на занятиях большого практикума. В пособии изложены основные методы определения концентрации белков, метод электрофореза в полиакриламидном и агарозном гелях, иммуноблоттинг белков.

    Ответственный за выпуск:

    председатель методической комиссии Института биологии и биомедицины ННГУ, д.б.н., проф. И.М. Швец
    УДК 577.2(076.5)

    ББК Е07-5я73




    © Нижегородский государственный

    университет им. Н.И. Лобачевского, 2015

    © Касатова Е.С., Луковникова Л.Б., Фомина С.Г., Горшкова Е.Н., Василенко Е.А., Калугин А.В., Новиков Д.В., Перенков А.Д., Астраханцева И.В., Новиков В.В., 2015


    СОДЕРЖАНИЕ


    ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………….

    4

    1. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ……………………………………………………

    5




    1.1.

    Определение концентрации белков ………………………..……………...

    5




    1.2.

    Электрофорез в полиакриламидном геле.………………………..............

    8




    1.3.

    Электрофорез в агарозном геле…………………………………………….

    10

    2. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ………………………………………………….….

    12




    ЗАНЯТИЕ №1. Определение концентрации белка с помощью метода Брэдфорда и спектрофотометрии………………………………………………...

    12




    ЗАНЯТИЕ №2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле……………...

    14




    ЗАНЯТИЕ №3. Иммуноблот…….....................................................................

    16

    ЛИТЕРАТУРА………………………………………………………………………

    18


    ВВЕДЕНИЕ

    Пособие предназначено для оказания помощи студентам в самостоятельной подготовке к практическим и лабораторным занятиям по методам исследования физико-химических свойств белковых молекул и выполнении курсовых и дипломных проектов.

    Проведение практических и лабораторных занятий направлено на освоение методов исследования белков. В соответствии с программой практическим занятиям предшествуют теоретические вопросы по изучаемым темам. Необходимо помнить, что практические занятия проводятся с целью углубления уже полученных ранее теоретических знаний и выработки практических умений и навыков в применении методов исследования физико-химических свойств белков.

    Основное время занятия посвящено выполнению практических заданий под руководством преподавателя. Перед выполнением задания необходимо внимательно изучить и уяснить содержание и особенности всех методов, выслушать инструктаж преподавателя о правилах обращения с лабораторным оборудованием, поскольку несоблюдение правил обращения с прибором может привести к его порче.

    В ходе выполнения задания его описание и результаты заносятся в спе­циальную тетрадь, которую после занятия сдают преподавателю для проверки в качестве отчета о выполнении работы.
    1. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

    1.1. Определение концентрации белков
    Традиционными методами оценки концентрации белка являются: измерение УФ-поглощения белковой пробы при 280 нм, метод с использованием бицинхониновой кислоты (БХК), анализ по Брэдфорду, определение белка по Лоури (табл.1), а также твердофазный иммуноферментный (ИФА, ELISA) анализ, Вестерн-блоттинг, масс-спектрометрия и другие типы исследования.

    Выбор метода определения белка
    У каждого из методов определения концентрации белка есть свои преимущества и недостатки. Решающим фактором при выборе метода являются физико-химические свойства исследуемого образца. Если в пробе преобладают белки, обогащенные аминокислотными остатками аргинина, рекомендуют использовать метод Лоури или реакцию с БХК, поскольку при определении с помощью метода Брэдфорда результаты будут завышены. В случае наличия в пробе цистеин – обогащенных белков завышенные результаты будет давать реакция с БХК, а применение методов Лоури и Брэдфорда позволит получить более точные значения. На результаты анализа напрямую влияет состав буферной смеси: так метод Лоури высокочувствителен к присутствию ЭДТА, что мешает образованию хромофора. Mетод БХК совместим с широким спектром детергентов, включая додецилсульфат натрия (ДСН), но не допускает наличия в растворе восстановителей, например 2-меркаптоэтанола. От нежелательных компонентов можно избавиться с помощью диализа, гель-фильтрации или путём осаждения белка с последующим растворением в соответствующем буфере.

    Для определения концентрации белка спектрофотометрическими методами используют калибровочный график, построенный для белка с известной концентрацией (чаще всего используют бычий сывороточный альбумин (БСА) или овальбумин). Готовят серийные разведения с известными концентрациями белка, на основе которых строится калибровочная кривая. Сравнение значений полученных для исследуемого белка с калибровочной кривой позволяет рассчитать его концентрацию.





    Спектрофотометрический метод. Измерение спектра поглощения в УФ-диапазоне — наиболее быстрый и простой метод определения концентрации белка, но и наименее точный. Метод основан на поглощении света ароматическими аминокислотами (тирозином и триптофаном). Метод чувствителен к значениям pH и ионной силы раствора, которые определяют пространственную организацию белков и их комплексов, а также к присутствию нуклеиновых кислот, которые могут вносить вклад в поглощение при 280 нм. Этот метод используют для быстрой оценки концентрации белка. Для расчета концентрации используют следующее уравнение:

    A280 (1 mg/mL) = (5690*N[Trp] + 1280 *N[Tyr] + 120 *N[Cys])/M

    N[Trp], N[Tyr] и N[Cys] – количество соответствующих оснований полипептида массой M, 5690, 1280 и 120 – коэффициенты экстинкции этих оснований

    В современных лабораториях часто используют спектрофотометры (например, серии NanoDrop™, Thermo Scientific), позволяющие производить точные измерения концентрации белка в очень малых объемах раствора (0,5-3 мкл).



    Анализ белка методом Лоури. Метод Лоури основан на двух реакциях. Первая заключается в образовании комплекса катионов меди (Сu2+) с амидными связями белка с последующим восстановлением меди в щелочных условиях. Получаемый продукт называется биуретовым хромофором, который стабилизируют добавлением тартрата. Во второй реакции полученный комплекс меди с белком восстанавливают реагентом Фолина. При этом происходит окрашивание раствора белка в синий цвет. Прозрачность раствора определяется спектрофотометрически в диапазоне длин волн 500 - 750 нм (обычно при 660 нм). Использование реагента Фолина повышает чувствительность биуретовой реакции почти в 100 раз. Недостатком метода является его чувствительность к таким соединениям как: детергенты, углеводы, глицерин, ЭДТА, Трис, соли калия, сульфгидрильные соединения, фенолы, гуанин, ксантин, магний и кальций. Помимо этого, метод малопригоден для измерения содержания гидрофобных белков.

    Анализ на основе бицинхониновой кислоты. Метод основан на взаимодействии ионов меди (Сu2+) c белками в щелочных условиях. Это приводит к переходу катионов Сu2+ в Сu1+, которые образуют комплекс с БХК, при этом цвет реагента меняется с зеленого на пурпурный. Результаты реакции детектируется при длине волны 562 нм. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации белка в растворе. Как и метод Лоури, метод БХК проводится в два этапа. Первый проводится при низких температурах и является результатом взаимодействия меди и БХК с аминокислотными остатками цистеина, цистина, триптофана и тирозина. Второй – при повышении температуры до 37°С. Достоинство метода состоит в том, что он нечувствителен как к ионным, так и неионным детергентам, поэтому может использоваться для исследования концентраций мембранных и гидрофобных белков. Восстановители и хелатирующие агенты препятствуют проведению реакции. По сравнению с другими методами, реакция с БХК является одним из наиболее чувствительных методов, имеет меньшую изменчивость и может быть использована для измерения широкого диапазона концентрации белка.

    Анализ белков методом Брэдфорда. Метод Брэдфорда является одним из наиболее популярных методов в связи с его простотой. Еще одним преимуществом является возможность измерять концентрацию белков с высокой молекулярной массой (MМ), поскольку краситель не связывается с пептидами с низкой ММ. Чувствительность метода составляет от 10 до 100 мкг/мл белка. Метод основан на прямом связывании красителя Кумасси G-250 с аминокислотными остатками аргинина, триптофана, тирозина, гистидина и фенилаланина белка. Максимум поглощения Кумасси G-250 в растворе приходится на длину волны 470 нм, в то время как комплекс красителя с аргинином поглощает при длине волны 595 нм, что позволяет оценивать соотношение красителя и белка. Ограничительным аспектом аналитического метода Бредфорда является несовместимость с присутствием значительных концентраций детергентов.

    Для относительной количественной оценки белка используют электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), с последующей окраской белков раствором Кумасси G-250 или R-250. Для этого проводят электрофорез в ПААГ исследуемого белка с контрольным образцом с известной концентрацией (например, БСА или овальбумин). После окрашивания сравнивают интенсивность окрашивания белковых полос, что позволяет ориентировочно оценить концентрацию белка с помощью компьютерных программ (ImageJ, Scion Image, TоtalLab Quant, Phoretics-1).

    Помимо вышеописанных способов для определения концентрации белка используются такие методы, как ИФА, Вестерн-блоттинг, и масс-спектрометрия.

    1.2. Электрофорез в полиакриламидном геле
    Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) — это метод позволяющий разделить смесь белков в соответствии с их электрофоретической подвижностью. Существует большое количество модификаций электрофореза белков в ПААГ. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН по Лэммли (англ. SDS PAGE). В присутствии додецилсульфата натрия выравниваются заряды всех белков и их подвижность связана только с различиями в их молекулярной массе.

    Этот метод часто используется для определения чистоты, гомогенности и молекулярной массы рекомбинантных белков. Сравнение электрофоретической подвижности исследуемого белка с маркером молекулярной массы позволяет охарактеризовать его физико-химические свойства. Электрофорез в ПААГ проводят в двух буферных системах: концентрирующем и разделяющем гелях. pH концентрирующего геля составляет 6,8, а разделяющего – 8,5.

    Выбор плотности геля зависит от молекулярных масс исследуемых белков (табл. 2). Просеивающие свойства геля определяются радиусом пор, который зависит от абсолютной концентрации акриламида и бисакриламида, используемых для приготовления геля. Размер пор в геле уменьшается с возрастанием концентрации полиакриламида. Наиболее часто используют акриламид : бисакриламид в соотношении 29:1, что позволяет разделять полипептиды, различающиеся всего на 3%.

    Таблица 2


    Диапазон эффективности разделения полипептидов в ПААГ


    Концентрация акриламида (%)

    Разрешение геля (kD)

    15

    12-43

    10

    16-68

    7,5

    36-94

    5

    57-212

    Электрофорез в ПААГ применяют для разделения коротких фрагментов нуклеиновых кислот, например, при секвенировании по Сэнгеру, визуализации полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, продуктов полимеразной цепной реакции или при оценке конформационного полиморфизма одиночных цепей ДНК.

    Результаты электрофореза визуализируют методами прямой окраски белков в геле с использованием специфических красителей (Кумаси G-250 или R-250, нитрат серебра). При разделении препарата, содержащего смесь полипептидов (например, лизат микроорганизмов), для обнаружения исследуемого белка используют перенос разделенных молекул из геля на носитель (вестерн-блоттинг). Детекцию исследуемого белка проводят с использованием специфичных антител. В качестве носителя выступает нитроцеллюлозная или поливинилиденфторидная (PVDF) мембрана.

    Различают следующие методы переноса белков на мембрану:



    • капиллярный блоттинг – поверх мембраны, прижатой к гелю, помещают стопку фильтровальной бумаги, при этом буфер для переноса поднимается под действием капиллярных сил по фильтровальной бумаге, что приводит к переносу макромолекул из геля на мембрану.

    • вакуумный блоттинг - аналогичен капиллярному блоттингу, но перенос ускоряется за счет использования вакуума вместо капиллярных сил.

    • электроблоттинг - перенос заряженных макромолекул на мембрану происходит под действием электрического тока.

    Единообразие и общая эффективность переноса может быть проверена окрашиванием мембраны красителями Кумасси R-250, amidoblack или Понсо С. При этом Кумасси R-250 и Понсо С являются более распространенными красителями.

    Для исключения ложных результатов, обусловленных взаимодействием между мембраной и антителами, осуществляют «блокирование», которое производится путем помещения мембраны в разбавленный раствор белка (БСА или обезжиренное сухое молоко) с небольшим процентом детергента (Tween 20, Triton X-100). Белок из разбавленного раствора связывается с мембраной в тех участках, где не прикрепился целевой белок. После этого антитела, участвующие в детекции, могут взаимодействовать только в специфических сайтах связывания. Сам процесс детекции осуществляется в два этапа. На первом этапе в систему вносят антитела, специфичные к целевому белку, на втором - антивидовые антитела, конъюгированные с ферментной меткой (аналогично методу ИФА), далее добавляют субстратный раствор, что приводит к окрашиванию областей, содержащих исследуемый белок.

    В альтернативных методах детекции используют вторичные антитела, связанные с флуорофором или радиоактивной меткой (например, изотоп йода). При этом белки могут быть определены не только качественно, но и полуколичественно.

    1.3. Электрофорез в агарозном геле
    В настоящее время электрофорез в агарозном геле является рутинным методом, используемым для исследования ДНК. Разработаны также модификации метода для электрофоретического исследования РНК и белков.

    Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле широко используется для разделения молекул нуклеиновых кислот (НК) по размеру. Агарозный гель служит своеобразным молекулярным ситом. В растворе НК несут суммарный отрицательный заряд за счёт диссоциации остатков орто-фосфорной кислоты (PO43-). Отрицательный заряд обуславливает движение НК в электрическом поле от катода к аноду. Величина этого заряда практически не зависит от окружающей среды, а отношение заряда к массе практически одинаково для всех НК. Поэтому разделение НК в агарозном геле при постоянном электрическом токе происходит за счёт различий между размерами молекул. Электрофорез в агарозе применяют для разделения НК молекулярной массой от 50 до20000 п.н.



    На электрофоретическую подвижность НК в агарозном геле влияют как свойства самих НК, так и условия проведения электрофореза.

    Длина нуклеотидной последовательности молекул НК. Чем длиннее молекула, тем медленнее она мигрирует в геле. Молекулы линейной двухцепочечной НК перемещаются в геле со скоростью, обратно пропорциональной десятичному логарифму молекулярной массы (числу нуклеотидных пар). Соответственно, молекулы большего размера мигрируют в геле медленнее из-за большего сопротивления трению и меньшей эффективности прохождения через поры.

    Конформация НК. ДНК, с одинаковой нуклеотидной последовательностью, но отличающиеся конформацией, имеют разную электрофоретическую подвижность. Например, кольцевая форма плазмидной ДНК будет мигрировать в геле быстрее, чем ее линейная форма. Концентрация агарозы. Электрофоретическая подвижность НК одного размера зависит от концентрации агарозы в геле. Выбор концентрации агарозы основывается на размере исследуемой нуклеиновой кислоты. Чем короче нуклеотидная последовательность, тем выше концентрация агарозы и наоборот, чем больше длина НК, тем меньше концентрация агарозы.

    Физико-химические характеристики электрофореза. Скорость миграции НК во многом определяется характеристиками электрического поля и химическим составом электродного буфера. Обычно используют напряженность от 0,5 до 5 В/см. Встраивание молекул красителя в двухцепочечную ДНК вызывает снижение её отрицательного заряда, а также увеличение её жесткости и массы. Присутствие интеркалирующего красителя в геле изменяет характеристики миграции НК. Например, образование комплекса, между НК и бромидом этидия, замедляет электрофоретическую подвижность в геле приблизительно на 15%, по сравнению с НК без красителя.

    2. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
    ЗАНЯТИЕ № 1. Определение концентрации белка методами Брэдфорда и спектрофотометрии
    Целью работы является сравнение методов Брэдфорда и спектрофотометрии для определения концентрации белка.
    Необходимые реактивы:

    1. Растворы бычьего сывороточного альбумина (БСА) с концентрацией 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1 мг белка в мл воды.

    2. Бидистиллированная (бд) или деионизированная (mQ) вода.

    3. Реагент Брэдфорда (готовится заранее): 2,5 мг Кумасси G-250 растворяют в 1,25 мл этилового спирта и осторожно добавляют 2,5 мл фосфорной кислоты до изменения окраски раствора на коричневый цвет. Общий объем раствора доводят до 23 мл водой (при этом возможно изменение цвета раствора) и оставляют при комнатной температуре на ночь. Далее добавляют 2 мл фосфорной кислоты и фильтруют через бумажный фильтр. Чистый раствор Брэдфорда имеет коричневый цвет и синеет при наличии белка.

    ВАЖНО! Реагент очень чувствителен к присутствию даже следовых количеств белка (1-2мкг/мл), поэтому необходимо работать в перчатках.
    Необходимое оборудование:

    1. Спектрофотометр для анализа микрообъемов.

    2. Планшетный спектрофотометр.


    Ход работы:
    1. Метод Бредфорда

    • Подготовить разведения исследуемого образца (с шагом в два раза). Для этого в 5 пробирок объемом 1,5 мл вносят по 10 мкл воды. В первую пробирку добавляют 10 мкл исследуемого образца и перемешивают. 10 мкл полученной смеси переносят в следующую пробирку и перемешивают. Процедуру повторяют до получения разведения в 32 раза.

    • В лунки 96-луночного планшета вносят по 120 мкл воды и по 5 мкл исследуемых и контрольных образцов согласно схеме, представленной на рисунке 1.


    Рис 1. Схема нанесения образцов в 96-луночный планшет


    К – отрицательный контроль (5 мкл воды mQ). С1-С5 – калибровочные растворы БСА известной концентрации в порядке ее возрастания. 1-6 – разведения исследуемого образца



    • Во все лунки планшета добавляют по 125 мкл реагента Брэдфорда, инкубируют при комнатной температуре в течение 5-10 минут, затем с помощью планшетного спектрофотометра измеряют поглощение при длине волны 595 нм.

    • На основе значений оптической плотности контрольных образцов в компьютерной программе Excel строят калибровочную кривую, представляющую собой зависимость оптической плотности раствора от заданной концентрации белка (рис. 2). На основании полученной кривой проводят линию тренда, уравнение которой используют для расчета концентрации белка в исследуемых образцах.

    Рис 2. Пример калибровочного графика для определения концентрации белковых растворов



    2. Спектрофотометрический метод

    • Проводят определение концентрации белка в исследуемых образцах с использованием спектрофотометра для микрообъемов, согласно инструкции производителя. Коэффициент молярной экстинкции БСА рассчитывают на основе аминокислотной последовательности, доступной в базе данных NCBI, с использованием компьютерной программы Protean.

    • Сравнивают результаты, полученные двумя методами.

    ЗАНЯТИЕ № 2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
    Целью работы является определение степени чистоты препарата белка.

    Необходимые реактивы:

      1. Раствор, содержащий 29% акриламида и 1 % N,N’-метиленбисакриламида в деионизованной воде.

    ВАЖНО! Акриламид и бисакриламид являются нейротоксинами, поэтому при приготовлении раствора обязательно пользоваться маской и перчатками.

      1. 10% раствор ДСН в воде.

      2. 1М раствор трис(гидроксиметил)аминометана (Трис) в воде, pH 6.8.

      3. 1,5М раствор Трис-HCl, pH 8.8.

      4. TEMED (N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамин).

      5. 10% раствор персульфата аммония в воде.

      6. Буфер для нанесения образцов (100 мМ Трис-HCl (pH 6.8,), 200 мМ β-меркаптоэтанол, 4% ДСН, 0,2 % бромфеноловый синий, 20% глицерин).

      7. Трис-глициновый электродный буфер содержит 25мМ Трис, 250 мМ глицина, 0,1% ДСН, рН 8,4.

      8. Раствор для окрашивания белков (0,25% Кумасси бриллиантовый синий (G-250), 50% этанола и 10% ледяной уксусной кислоты).


    Необходимое оборудование:

    1. Источник постоянного тока.

    2. Камера для вертикального электрофореза.

    3. Емкости для заливки геля.


    Ход работы:

    • Собирают ячейку для заливки геля, используя чистые обезжиренные стеклянные пластины.

    • Готовят верхний и нижний гели согласно таблице 3. Полимеризация начнется после добавления TEMED, поэтому его следует добавлять непосредственно перед заливкой геля.

    Таблица 3
    Растворы для приготовления верхнего и нижнего гелей для Трис-глицинового ДСН-полиакриламидного геля
    Нижний гель

    Компоненты раствора

    На15 мл

    H2O

    5,9 мл

    30% акриламид/бисакриламид

    5,0 мл

    1,5 М Трис (pH 8,8)

    3,8 мл

    10% ДСН

    0,15 мл

    10% персульфат аммония

    0,15 мл

    TEMED

    0,006 мл

    Верхний гель

    Компоненты раствора

    На 5 мл

    H2O

    3,4 мл

    30% акриламид/бисакриламид

    0,83 мл

    1,5 М Трис (pH 6,8)

    0,63 мл

    10% ДСН

    0,05 мл

    10% персульфат аммония

    0,05 мл

    TEMED

    0,05 мл




    • В пространство между стеклянными пластинами заливают приготовленный раствор нижнего геля, оставляя 1-1,5 см пространства для верхнего геля. Аккуратно наслаивают 96% этанол на поверхность нижнего геля и оставляют ячейку при комнатной температуре до полимеризации геля (15-30 мин).

    • Этанол удаляют с помощью фильтровальной бумаги.

    • В оставшееся пространство заливают верхний гель и вставляют гребенку, избегая попадания воздушных пузырьков.

    • После полимеризации геля (15-30 мин), собирают камеру для электрофореза и заливают Трис-глициновым электродным буфером.

    • Аккуратно удаляют гребенку. Сформировавшиеся лунки промывают Трис-глициновым электродным буфером для удаления остатков геля.

    • Исследуемые образцы смешивают с буфером для нанесения в соотношении 1:1 и инкубируют при 100°С в течение 3 мин.

    • В лунки геля вносят 15 мкл подготовленных образцов.

    • Подсоединяют камеру для электрофореза к источнику тока и подают напряжение из расчета 8В на 1см2 геля. За миграцией образцов наблюдают по подвижности красителя (бромфенолового синего). После того, как краситель мигрирует в нижний гель, напряжение увеличивают до 15 В/см2. Электрофорез проводят, пока краситель не дойдет до конца геля (3-4 часа).

    • Отключают электропитание и сливают электродный буфер из камеры, извлекают гель.

    • Гель инкубируют 1 час в растворе для окрашивания белков.

    • Не связавшийся краситель вымывают из геля раствором, содержащим 10% этанола и 5% ледяной уксусной кислоты на качалке.

    • Белки распределяются в геле в соответствии с их молекулярной массой в виде полос, окрашенных в синий цвет.



    ЗАНЯТИЕ № 3. Иммуноблот
    Целью работы является качественное обнаружение рекомбинантного белка в лизате клеток E.coli методом иммуноблота.
    Необходимое оборудование:

    1. Шейкер.

    2. Прибор для проведения переноса.

    3. Одноразовые перчатки.

    4. Перманентный маркер.

    5. Простой карандаш.

    6. Пинцет.

    7. Мембрана PVDF для переноса (Millipore, США).

    8. Фильтровальная бумага.


    Необходимые реагенты:

    1. Поликлональные антитела кролика против рекомбинантного белка.

    2. Поликлональные антитела против IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена.

    3. Субстратный раствор, содержащий тетраметилбензидин (Microgen, Германия).

    4. Трис-глициновый буфер (50мМ Трис, 40 мМ глицин).

    5. Десятикратный раствор фосфатно-солевого буфера, pH 7,4 (20 мМ КH2PO4, 50 мМ Na2HPO4, 1,5М NaCl). Для приготовления рабочего раствора десятикратный раствор разводят в 10 раз.

    6. Блок-раствор (5% раствор сухого обезжиренного молока в рабочем фосфатно-солевом растворе).

    7. Промывочный раствор (5% раствор сухого обезжиренного молока, 1% Tween-20 в рабочем фосфатно-солевом растворе).

    8. Десятикратный раствор красителя Понсо С (2% Понсо С, 30% ТХУ, 30% сульфосалициловой кислоты в воде). Для приготовления рабочего раствора десятикратный раствор разводят в 10 раз рабочим фосфатно-солевым раствором.



    Ход работы:

    • Проводят электрофорез белков в ПААГ как описано в занятии №2.

    • Из фильтровальной бумаги и PVDF мембраны вырезают прямоугольники, соответствующие по размерам гелю. Мембрану смачивают в изопропаноле, фильтровальную бумагу пропитывают трис-глициновым буфером.

    • На анод последовательно кладут 4-5 слоев фильтровальной бумаги, избегая попадания пузырей воздуха между слоями, PVDF мембрану, гель, и 5 слоев фильтровальной бумаги.

    • Полученную конструкцию накрывают катодом и подключают к источнику тока. Силу тока рассчитывают исходя из размера геля. Для геля площадью 100 см2 перенос осуществляют при 80 мА в течение 1 часа.

    • Извлекают мембрану и инкубируют в течение 10-15 минут в растворе красителя Понсо С при покачивании. Мембрану отмывают дистиллированной водой. Белки окрашиваются на мембране в розовый цвет. Простым карандашом отмечают верхний край мембраны и места окрашивания белков маркера молекулярных масс.

    • Мембрану инкубируют в Блок-растворе при комнатной температуре 1 час.

    • Переносят мембрану в раствор, содержащий поликлональные антитела кролика против рекомбинантного белка в Блок-растворе. Инкубируют при покачивании 5-7 часов при 4ºС.

    • Мембрану отмывают три раза по 5 минут с использованием промывочного раствора и вносят поликлональные антитела против IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена. Инкубируют 40 минут при комнатной температуре и покачивании.

    • Мембрану отмывают три раза по 5 минут с использованием промывочного раствора и вносят субстратный раствор. Мембрану инкубируют до окрашивания белков в коричневый цвет.



    ЛИТЕРАТУРА


    1. Pan, S. Mass spectrometry based targeted protein quantification: methods and applications / S. Pan, R. Aebersold, R. Chen, J. [et al.] // J. Proteome Res. – 2009. – V.8. – P. 787-797.

    2. Olson, B. Assays for determination of protein concentration / B. Olson, J. Markwell // Curr Protoc Protein Sci. – 2007. – Ch. 3. – Unit 3.4.

    3. Гааль, Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи. – М.: Мир, 1982. – 446 с.

    4. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман. – М.: Наука, 1981. 288 с.

    5. Маниатис, Методы генетической инженерии / Т. Маниатис, Фрич Э., Сэмбрук Дж. – М.: МИР. Молекулярное клонирование, 1984. – 478 с.

    6. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / J. Sambrook, D. Russell. – Chapter 5. – New-York: CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001.

    7. Сомма, М., Кверчи М. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов / М. Сомма, М. Кверчи. – Сессия 5. Электрофорез в агарозном геле. – ВОЗ. – 13 с.

    8. Ребриков, Д.В. ПЦР в реальном времени / Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов. – 4-е изд. – М.: БИОМ. Лаборатория знаний, 2013. – 223 с.


    Пособие к практическим занятиям по молекулярной биологии.

    ЧАСТЬ 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

    Авторы:


    Елена Сергеевна Касатова

    Любовь Борисовна Луковникова

    Светлана Григорьевна Фомина и др.


    Учебно-методическое пособие

    Федеральное государственное автономное

    образовательное учреждение высшего образования

    «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского».

    603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.
    Подписано в печать. Формат 60х84 1/16.

    Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура Таймс.

    Усл. печ. л. . Уч.-изд. л.

    Заказ № . Тираж 200 экз.

    Отпечатано в типографии Нижегородского госуниверситета

    им. Н.И. Лобачевского

    603600, г. Нижний Новгород, ул. Большая Покровская, 37

    Л

    ицензия ПД № 18-0099 от 14.05.01




    Коьрта
    Контакты

        Главная страница


    Полимеразная цепная реакция (пцр) — метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты

    Скачать 329.3 Kb.