Скачать 139.98 Kb.


Дата31.03.2019
Размер139.98 Kb.
ТипАнализ

Скачать 139.98 Kb.

Публиковани радови



УНИВЕРЗИТЕТ У КРАГУЈЕВЦУ

МЕДИЦИНСКИ ФАКУЛТЕТ

КРАГУЈЕВАЦ


  1. Одлука Изборног већа

Одлуком Изборног већа Медицинског факултета Универзитета у Крагујевцу, број 01-8835/3-5 од 1.12.2010. године, именовани су чланови комисије за оцену научне заснованости теме докторске дисертације кандидата мр пх Драгице Бојовић, под називом:

Анализа хемијског састава и биолошке активности шарпланинског чаја, Sideritis scardica Griseb., Lamiaceae

Чланови комисије су:



1. проф. др Слободан Јанковић, председник, редовни професор Медицинског факултета Универзитета у Крагујевцу за уже научне области Фармакологија са токсикологијом и Клиничка фармација

2. др сци Вања Тадић, члан, научни саветник Института за проучавање лековитог биља „др Јосиф Панчић“ у Београду, за ужу научну област Фитохемија и фармакогнозија

3. проф. др Драган Миловановић, члан, ванредни професор Медицинског факултета Универзитета у Крагујевцу за ужу научну област Фармакологија и токсикологија
2.1 Кратка биографија кандидата
Драгица Бојовић је рођена 15.10.1958. у Врбасу, Србија. Основну школу и гимназију завршила је у Никшићу, а Фармацеутски факултет у Сарајеву 1997-1982. Године. Специјализацију из фармакогнозије на Фармацеутском факултету у Београду завршила је 1992. године, одбранивши специјалистички рад са темом „Алкалоиди коре нара са подручја Црне Горе“. Уписала је Докторске академске студије на Медицинском факултету у Крагујевцу 2007 године, и положила усмени докторски испит 9.7.2009.

Драгица Бојовић је приправнички стаж обавила у апотеци Никшић, у којој је затим радила још 5 година. У периоду од 1992-1997 радила је као специјалиста за љековито биље. Са колегиницама из фармацеутске технологије и контроле лекова организовала је прву производњу у Галенској лабораторији Апотекарске установе Црне Горе, за потребе 40 апотека. Од 1997 године, одлуком Владе Црне Горе Галенска лабораторија прелази у састав новоосноване фармацеутске куће ICN Црна Гора



Од 2006 године, ICN Црна Гора мења име у Галеника Црна Гора, где Драгица Бојовић данас ради као руководилац Сектора контроле квалитета. Од септембра 2009 године ангажована је као Стручни сарадник на Студијском програму фармације Универзитета у Подгорици, на предмету фармакогнозија.


2.2 Наслов, предмет и хипотезе докторске тезе
Наслов:Анализа хемијског састава и биолошке активности шарпланинског чаја, Sideritis scardica Griseb., Lamiaceae.
Предмет: Ова студија ће се бавити испитивањем фармаколошких својстава (антиоксидативно, цитотоксично, анти-инфламаторно и гастропротективно деловање) екстраката добијених из надземних делова биљне врсте Sideritis scardica Griseb., Lamiaceae, као и анализом хемијског састава екстраката добијених из надземних делова ове биљке.
Хипотезе:

  • Фенолна једињења, поред етарског уља, су главни конституенси испитиваних екстраката;

  • Екстракти надземних делова биљке поседују антиоксидативно, цитотоксично, анти-инфламаторно и гастропротективно дејство;

  • Употреба екстраката надземних делова биљне врсте Sideritis scardica Griseb., Lamiaceae у традиционалној медицини је оправдана;

  • Цитотоксични потенцијала испитиваних екстраката је такав да оправдава даља истраживања његове ефикасности и безбедности у превенцији и/или лијечењу туморских обољења гастроинтестиналног тракта код животиња.


2.3 Подобност кандидата
Кандидат је објавио један рад у целини у домаћем часопису са рецензијом, у коме је први аутор, чиме је испунио услов за пријаву докторске тезе:


  • Драгица Р. Бојовић, Снежана М. Цупара, Вања М. Тадић, Зорица Р. Потпара, Јестиве аутохтоне биљке у Црној Гори. Рационална терапија 2010; 2(1): 17-25. (Часопис има рецензије, није категорисан)


2.4. Преглед стања у подручју истраживања
Љековите и ароматичне биљке представљају богат извор индустријских сировина, за фармацеутску, козметичку и прехрамбену индустрију. Употребљавају се у изради хербалних лијекова, козметичких и хигијенских препарата, зачина, биљних додатака за функционалну храну и др. У литератури је доста података који се односе на састав, дјеловање и примјену љековитог биља у отклањању тегоба насталих услед поремећаја здравља. Новија истраживања у области природних љековитих сировина биљног поријекла усмјерена су првенствено на упознавање и биљних врста, до сада непознатих као љековитих, као и на изучавање активних састојака, носилаца фармаколошке активности.

Sideritis scardica Griseb. Lamiaceae, од давнина се употребљава у традционалној медицини за ублажавање тегоба код гастроинтестиналних поремећаја. Слиједећи савремени приступ у примјени љековитих биљака у фармацији и медицини, кроз рад на овој теми дефинисаће се биолошка активност водено-етанолног екстракта (најчешће употребљаваног у циљу добијања стандардизованог, сувог екстракта) у односу на окарктерисани хемијски састав испитиваних узорака. Активност одговарајућих екстраката који ће бити предмет испитивања сагледана у контексту њиховог хемијског састава послужиће као основ за даља истраживања рационалне и оправдане примјене испитиване врсте у савременој медицини. И етарско уље наведене врсте, у литератури није детаљно описано, а мало је података о саставу и дјеловању екстраката ове биљке.

У свјетској флори, породица уснатица (Lamiaceae) је заступљена са 264 родoва и преко 3200 врста, распрострањених готово по читавој земљиној кугли. Ипак, највеће богатство и диверзитет родова и врста забиљежени су у Медитерану. Врста Sideritis scardiga Griseb., у народу познат као шарпланински чај ( планински чај, грчки чај) самоникло је заступљена на локалитетима Србије, Косова, Македоније, Грчке, Италије.



2.5. Значај и циљ истраживања са становишта актуелности у одређеној научној области
Циљеви. Ова докторска теза има следеће циљеве:

  1. Урадити карактеризацију хемијског састава етанолно-водених и етарског, етилацетатног и н-бутанолног екстракта надземног дијела самоникле биљне врсте Sideritis scardica Griseb., Lamiaceae

  2. Спровести in vitro експерименте за утврђивање антиоксидативне, цитотоксичне ативности испитиваних екстраката

  3. Спровести in vivo експерименте за утврђивање антиинфламаторног и гастропротективног дјеловања испитиваних екстраката


Значај. Истраживање ће на основу фармаколошких и фармакогнозијских испитивања показати оправданост досадашње употребе самониклe vrste Sideritis scardica Griseb., Lamiaceae у традиционалној медицини, као и указати на могуће правце даљих истраживања фармаколошких својстава ове биљке и евентуалну употребу у званичној медицини. Такође, биће освојена техника формулације препарата од екстраката ове биљне врсте намијењеног унутрашњој употреби, за ублажавање тегоба код гастроинтестиналних обољења.
2.6 Веза са досадашњим истраживањима
Самоникла врста Sideritis scardica Griseb., Lamiaceae није до сада описивана као биљка са лековитим својствима у научној медицини. Међутим, њени водени екстракти се вековима користе у виду чаја за ублажавање гастроинтестиналних поремећаја. У литератури нема података о испитивању фармаколошких ефеката екстраката ове биљне врсте, али је једно недавно истраживање материјала прикупљеног у Македонији и Бугарској показало присуство алфа кадинола, дитерпена и октадеценола у алкохолним екстралктима.

2.7 Методе истраживања
Поријекло биљне сировине

За потребе остваривања циљева ове докторске дисертације, биљни материјал, надземни дијелови су сакупљени на Шар-планини, Љуботен, и/или добијени из Македоније.

Узорци су сушени на природан начин, прострти у танком слоју, на промајном мјесту, заштићени од свјетлости, уз свакодневно превртање.
Припрема етарског уља, водено-етанолног, етарскг, етил-ацетатног и н-бутанолног екстракта испитиване биљне врсте

Етарско уље испитиванe врстe се добија дестилацијом помоћу водене паре у апарату по Клевенџеру, методом прописаном у Ph. Jug. IV. Садржај етарског уља се изражава процентуално, у односу на суву масу биљног материјала.

Водено-етанолни екстракт је добијен екстракцијом на 60 0Ц 85% етанолом. Добијени екстракт је упараван до сува на вакуум упаривачу и одређиван је принос екстракције, у процентима у односу на суву масу. Етарски екстракт је добијен након третирања сировог екстракта врелом водом. Добијени раствор је екстрахован сукцесивно прво етром до обезбојавања, затим етил-ацетатом И на крају н-бутанолом,при цему су добијени екстракти разлиците поларности.

Принос екстракције је изражаван процентуално, у односу на суву масу.


Хемијска карактеризација испитиваних узорака

Садржај етарског уља је одређује се према пропису Ph. Jug IV.

Квалитативна и квантитативна анализа етарског уља радиће се на:

GC и GC/MS апаратима. Услови анализе би били следећи: аналитички гасни хроматограф GC-A Varian model 3400, split/splitless инјектором (250 0C) и 30 m x 0.32 mm DB-Wax silica kapilarnom колоном и FID ( 300 0C) коришћен за GC i GC/MS анализу. Мјерења би се радила под условима градијентног температурног мода, од 50 0С, 3 мин, а затим до 200 0С уз пораст температуре 10 0С/мин. Гас носач је био 3 ml H2/min. Површина пикова се рачуна електронски од стране Varian DS-604.

GC/MS – гасни хроматограф је спојен преко отвореног спли моста и затопљене силицијумове капиларе (250 0С) са јонским извором Finnigan MAT 8230 масеног спектрометра који је опремљен компјутером(PDP 11/74 ). Радни услови: гас носач 2 ml He/min; остали GC услови као горе већ поменути. MS-извор јона (electron impact), 170 0C , 70 eV. Конституенси ће бити идентификовани коињектирањем одговарајућих стандарда и поређењем њихових масених спектара са оним из MS библиотеке једнињења (Wiley, 1984), узимајући у обзир релативна ретенциона времена.5

За одређивaње садржаја активних једињења у испитиваним узорцима користиће се званичне методе Ph. Eur. 6, Ph. Jug. IV i HPLC метода. Узорци би се припремали према одговарајућим прописима, који су наведени у методама : садржај танина, флавоноида по DAB X, испитивање етарског уља.



  • Садржај танина би се одређивао по Ph. Eur. 6.0

  • Садржај флавоноида би се одређивао по DAB X (Проценат флавоноида изражаван као хиперозид представља средњу вриједност ±стандардна девијација три мјерења. Узорци се екстрахују смјесом ацетона и HCl загријавањем на воденом купатилу уз повратни хладњак. Додатком AlCl3 настаје обојени комплекс; комплекс се екстрахује етил-ацетатом и његова абсорбанција се мјери UV-VIS спектрофотометром HP 8453 na 425 nm . 6,7

  • Одредјивање укупних фенола би се радило по модификованој Folin-Ciocalteu методи ( Принцип методе: 100μл сувог метанолног екстракта испитиваних биљних врста (62, 124 и 310 μг/мЛ коначне концентрације) помијешано је са 0.75 мЛ Folin-Ciocalteu регенса (претходно 10 пута разблаженог дестилованом водом). Та смјеса се оставља на t 22 0С да одстоји 5 мин; послије тога смјеси се додаје 0.75 мЛ раствора Na-bikarbonata (60 g/L). Након 90 мин на t 22 0С, абсорбанција се мјери на UV-VIS спектрофотометру HP 8453 на 725 nm. Резултати представљају садржај еквивалената галне киселине. 8,9,10

  • Одређивање садржаја флавоноида и фенилкарбонских киселина у биљном материјалу прије и послије хидролизе

Припрема узорка

За одређивање флавоноида и феникарбонских киселина HPLC методом, узорци се припремају на сљедећи начин:

Испитивана дрога се самeље. Одмјери се 1,00 г хомогене испулверизоване дроге, пренесе у балон, дода 10 мл метанола и загијава са повратним хладњаком 30 минута. Раствор се профилтрира преко вате у одмјерни суд од 25 мл, вата добро исциједи и врати у балон, а екстракција понови још 2 пута са 10 и 5 мл метанола. Добијени екстракти се споје са првим у одмјерном суду од 25 мл. Суд се допуни метанолом до ознаке. Добијени раствор се профилтрира кроз PTFE (политетра-флуоретилен) мембрански филтер.

Припрема хидролизованих узорака:

Одмјери се тачно око 175,00 мг хомогене испулверизоване дроге, пренесе у балон, дода10 мл метанола и 2,5 мл концентроване хлороводоничне киселине и загијава са повратним хладњаком 2,5 сати на температури од 85°Ц. Када се раствор охлади, пренесе се из балона у одмјерни суд од 25 мл, дода 10 мл метанола, држи на ултразвучном купатилу 10 минута и суд допуни метанолом до ознаке. Раствор је стабилан 24 сата.

Прије HPLC анализе, раствори се филтрирају кроз 0.2 μм PTFE филтере. Ињектовани волумени за растворе испитиваних узорака, као и за растворе стандардних супстанција били би 4 μL. Идентификација једињењења се ради поређењем ретенционих времена са спектралним карактеристикама. Када су спектралне карактеристике једињења из испитиваног узорка идентичне са спектралним карактеристикама стандардних супстанци, резултати су били потврђивани упоређивањем са спектрима стандарда провјером чистоће пикова. Пикови који не испуњавају ове захтјеве не квантификују се. Квантификација се уради примјеном калибрационе криве методом екстерног стандарда.

HPLC метода

Хроматографски услови:


  • Хроматографски систем: HPLC System 1200 Agilent Technologies са бинарном пумпом, PDA детектором и аутосамплером 11

  • Колона: LiChrospher 100 RP-18e (250 x 4,6 mm x 5 µm)

  • Мобилна фаза А: Отпипетира се 9,8 ml 85% ортофосфорне киселине и раствори у 500 ml воде HPLC чистоће.

  • Мобилна фаза Б: Acetonitril

Програм рада пумпи:

0 min 11% B

0-35 min 11-25% B

35-55 min 25-40% B

55-60 min 40-65% B

60-70 min 65-100% B


Таласна дужина детекција: 360 nm, 280 nm, 325 nm

Вријеме трајања анализе: 70 минута

Раствори стандарда (сви раствори се добијају растварањем стандардних супстанци у метанолу):



Standard rutina: 0.019 mg/ml

Standard hiperozida: 0.022 mg/ml

Standard izokvercitrina: 0.044 mg/ml

Standard quercetin-dihidrata: 0.020 mg/ml

Standard apigenin-7-O-glukozida: 0.062mg/ml

Standard apigenina: 0.035 mg/ml

Standard viteksina: 0.042 mg/ml

Standard viteksin-2-O-ramnozida: 0.042mg/ml

Standard luteolin-7-O-glukozida: 0.0045mg/ml

Standard luteolina: 0.0045 mg/ml

Standard kafene kiseline: 0.026 mg/ml

Standard hlorogenske kiseline: 0.024 mg/m

Standard protokatehina: 0.012 mg/ml

Standard gentizinske kiseline: 0.0128 mg/ml

Standard vanilične kiseline: 0.0124 mg/ml

Standard siringične kiseline: 0.0144 mg/ml

Standard p-kumarina: 0.0136 mg/ml

Standard ferula kiseline: 0.0124 mg/ml

Standard sinapične kiseline: 0.0112


In vitro испитивање антиоксидативне и микробиолошке активности
Испитивање антиоксидативног потенцијала испитиваних узорака спровело би се примјеном DPPH методе. DPPH (α,α-Difenil-β-pikrilhidrazil) тест се спроводи у складу са процедуром коју је предложио Blois, са незнатним модификацијама.35

Различите концентрације узорака (100 μL) помијешане су са 900 μL 0.04 mg/mL метанолног раствора DPPH. UV спектри се снимају на UV-VIS Спектрофотомеру HP 8453. Абсорбанција на 517 nm мјерена је послије 20 мин. Проценат инхибиције израчунава се примјеном следеће формуле:

I = [(Ac-As)/Ac] × 100

гдје је I проценат инхибиције, Ac је абсорбанција негативне контроле (садржи 100 μL MeOH умјесто испитиваног узорка), и As је абсорбанција испитиваног узорка. Синтетски антиоксиданти, чије је антиоксидативно својство валидирано, troloks и t-butil hidroksitoluen (BHT), коришћени су као позитивне контроле. Проценат инхибиције се приказује у функцији концентрације испитиваних узорака, а EC50-вриједности, одређене примјеном линеарне регресионе анализе, представљају средњу вриједност ± стандардна девијација три одређивања. Рачунање EC50 вриједности је засновано на садржају укупних фенола у екстракту.



In vitro антимикробна активност испитиваних екстраката тестираће се у односу на контролне сојеве који припадају ATC колекцији, Meryland, USA:

Грам позитивни сојеви :

Staphylococcus aureus ATCC 25923,

Streptococcus epidermidis ATCC 12228,

Bacillus subtilis ATCC 6051,

Micrococcus luteus ATCC 10240,

Micrococcus flavus ATCC 14452,

Lysteria monocytogenes ATCC 15313,

Enterococcus faecalis ATCC 19433,

Sarcina lutea 10054;

Грам негативни сојеви:

Escherichia coli ATCC 25922,

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,

Pseudomonas talaasii NCTC 387,

Salmonella typhimurium ATCC 14028,

Salmonella enteritidis ATCC 13176,

Proteus mirabilis ATCC 14273;

Гљивице:

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763,

Candida albicans (ATCC 10231).
Спровешће се анализа диск-дифузионом методом, мјерењем величине зона инхибиције раста Грам-позитивних и Грам-негативних бактерија, као и патогених. Стандардни антибиотици, стрептомицин и нистатин (10 μg/mL) се користе као контрола сензитивности тестираних бактерија и гљивица. Испитивани узорци се растварају у DMSO. Као слијепа контрола употријебљава се диск са растварачем. Muller-Hinton Agar се употријебљава за раст бактеријских сојева, а Sabouraud Maltose Agar за гљивице. Све агар плоче се припремају у 90-mm Петри шоље, са 25 ml агара, дебљина агар до 4 mm. MIC, минимална инхибиторна концентрација одређена је микродилуционом методом.12,13,14
In vivo испитивање антиинфламаторног и гастропротективног дјеловањa
Одрасле, мушке јединке Wistar пацова, масе 200-300 g, користиће се за валидирање антиинфламаторне (карагенином индкован едем шапице пацова) и гастропротективне (концентрованим етанолом индукован улкус желуца) активности. Експерименталне групе се састоје од 6-10 животиња. Животиње не једу 18-20 сати прије почетка експеримента, а имају слободан приступ води.15,16

Карагенином индукована инфламација шапице пацова.

Карагенином индукован едем шапице пацова представља експериментални модел за испитивање антиинфламаторне активности, према модификованој методи коју су дали Oyanagui and Sato 17 Испитивани екстракти се апликују p.o.у дозама од 50, 100, 200 mg/kg. Индометацин, растворен у DMSO, представља референтну супстану у дози од 4 mg/kg p.o. условљавајући 50% смањење едема на шапици пацова. Контролним животињама се даје DMSO у дози од 1 mg/kg p.o. Раствор карагенина у физиолошком раствору (0.5% у запремини од 0.1 mL) се апликује на плантарну површину десне шапице пацова један сат након оралне администрације испитиваних екстраката или индометацина. Физиолоски раствор (0.9% NaCl, 0.1 mL) ињектује се у лијеву шапицу пацова, која представља контролу(шапица која није захваћена инфламацијом). Животиње се жртвују 3 сата послије апликације карагенина, а шапице се осјеку и измјере. Разлика у тежини између десне и лијеве шапице пацова, одн. шапице која је била захваћена инфламацијом и контролне, представља показатељ интезитета инфламаторног одговора (односно антиинфламаторне активности). Проценат антиинфламаторног ефекта је израчунат из израза:


ke


k


Антинфламаторни ефект (%) = x 100

гдје Δк представља разлику у тежини шапице пацова у контролној групи; Δе је разлика тежине шапице пацова у третираној групи.



Акутни улкус изазван концентрованим етанолом код пацова.

У циљу испитивања гастропротективне активности екстраката биљака које су предмет овог истраживања користио би се модел акутног оштећења мукозе желуца концентрованим етанолом (1 mL/rat p.o.). Испитивани екстракти, растворени у DMSO, апликују се p.o. у дозама од 5-20 mg/kg p.o 60 мин прије етанола. Ранитидин, дат у дозама од 5-20 mg/kg p.o., представља референтни лијек. Контролна група животиња се третира само растварачем у дози од 1mL/kg p.o., такође 60 мин прије етанола. Животиње се жртвују 1 сат послије апликације етанола и њихови желуци се одстране, а затим отворе дуж већег лука. Лезије се испитују под лупом (3×). Интезитет гастричних лезија се процјењује по модификованој 8-бодовној скали по Adami et al.




Статистичка анализа.
Проналажење везе између показаних in vitro и in vivo ефеката и хемијског састава била би основа за статистичку анализу. Корелација између концентрације активних компонената у екстрактима самониклих Satureja врста и њиховог антиинфламаторног или неког другог ефекта радили би се према Spearman-ovoj анализи корелације рангова. Ако се утврди да је сигнификантност p<0.05 , значи да постоји корелација између параметара.
2.8 Очекивани резултати докторске дисертације
Ова докторска теза ће имати следеће очекиване резултате :

  • Показаће се да су фенолна једињења, поред етарског уља, главни конституенси испитиваних екстраката;

  • Показаће се да екстракти надземних делова биљке поседују антиоксидативно, цитотоксично, анти-инфламаторно и гастропротективно дејство.




    1. Оквирни садржај дисертације


Ово истраживање врсте Sideritis scardica Griseb. Lamiaceae одвијаће се кроз: (1) хемијску карактеризацију водено-етанолног екстракта и његових фракција различите поларности (укупни воденоетанолни екстракт,ињегове фракције, етарска, етил ацетатна и н-бутанолна), и (2) испитивање антимикробног, цитотоксичног, антиинфламаторног и гастропротективног потенцијала екстраката надземних дијелова наведене врсте.
2.10 Научна област дисертације
Медицина и фармација. Ужа областа фармакогнозија.

2.11 Научна област чланова комисије
1. проф. др Слободан Јанковић, председник, редовни професор Медицинског факултета Универзитета у Крагујевцу за уже научне области Фармакологија са токсикологијом и Клиничка фармација

2. др сци Вања Тадић, члан, научни саветник Института за проучавање лековитог биља „др Јосиф Панчић“ у Београду, за ужу научну област Фитохемија и фармакогнозија

3. проф. др Драган Миловановић, члан, ванредни професор Медицинског факултета Универзитета у Крагујевцу за ужу научну област Фармакологија и токсикологија

Закључак и предлог комисије
1. На основу досадашњег успеха на докторским студијама и публикованих радова, мр. пх Драгица Бојовић испуњава све услове за одобрење теме и израду докторске дисертације.

2. Предложена тема је научно оправдана, дизајн истраживања је прецизно

постављен и дефинисан, методологија je јасна. Ради се о оригиналном научном делу, где се испитују антимикробно, антиинфламаторно и гастропротективно дејство екстраката биљне врсте Sideritis scardica Griseb. Lamiaceae.

3. Комисија сматра да ће предложена докторска теза мр. пх Драгице Бојовић бити од великог научног и практичног значаја, да се сагледају биолошки ефекти екстраката биљне врсте Sideritis scardica Griseb. Lamiaceae.

4. Комисија предлаже Изборном већу Медицинског факултета у Крагујевцу да прихвати пријаву теме докторске дисертације кандидата мр. пх Драгице Бојовић под називом Анализа хемијског састава и биолошке активности шарпланинског чаја, Sideritis scardica Griseb., Lamiaceae. и одобри њену израду.
проф. др Слободан Јанковић, председник, редовни професор Медицинског факултета Универзитета у Крагујевцу за уже научне области Фармакологија са токсикологијом и Клиничка фармација
_______________________________________________

др сци Вања Тадић, члан, научни саветник Института за проучавање лековитог биља „др Јосиф Панчић“ у Београду, за ужу научну област Фитохемија и фармакогнозија
________________________________________________

проф. др Драган Миловановић, члан, ванредни професор Медицинског факултета Универзитета у Крагујевцу за ужу научну област Фармакологија и токсикологија
_________________________________________________

У Крагујевцу, 18.12.2010.






Коьрта
Контакты

    Главная страница


Публиковани радови

Скачать 139.98 Kb.